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Jul 17, 2023

Escala de eficiencia para la dispersión de partículas luminiscentes vinculada a propiedades espectroscópicas fundamentales y mensurables

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 6254 (2023) Citar este artículo 514 Accesos Detalles de métricas Comparación del rendimiento de luminóforos moleculares y a nanoescala y micro y luminiscentes

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 6254 (2023) Citar este artículo

514 Accesos

Detalles de métricas

Comparar el rendimiento de luminóforos moleculares y a nanoescala y micropartículas y nanopartículas luminiscentes y estimar las amplitudes de señal alcanzables y los límites de detección requiere una escala de intensidad estandarizable. Esto inició el desarrollo de las escalas relativas MESF (número de moléculas de fluorocromos solubles equivalentes) y ERF (fluoróforos de referencia equivalentes) para citometría de flujo y microscopía de fluorescencia. Ambas escalas de intensidad se basan en valores de intensidad de fluorescencia asignados a perlas de calibración fluorescentes mediante una comparación de intensidad con soluciones de fluoróforos espectralmente muy parecidas de concentración conocida utilizando un espectrofluorómetro. Alternativamente, se puede determinar el brillo del luminóforo o de la perla (B) que es igual al producto de la sección transversal de absorción (σa) en la longitud de onda de excitación (σa(λex)) y el rendimiento cuántico de fotoluminiscencia (Φpl). De este modo, se puede lograr una escala absoluta basada en propiedades espectroscópicas fundamentales y mensurables que es independiente del tamaño de partícula, el material y la densidad de tinción o etiquetado del luminóforo y considera la sensibilidad de las propiedades ópticas de los luminóforos a su entorno. Con el objetivo de establecer dicha escala de brillo para dispersiones de partículas luminiscentes con tamaños superiores a unos pocos diez nanómetros, demostramos cómo el brillo de partículas de poliestireno (PSP) de tamaño cuasi monodisperso de 25 nm, 100 nm y 1 µm, cargadas con Se pueden obtener dos tintes diferentes en concentraciones variables con una única configuración de esfera integradora diseñada a medida que permite la determinación absoluta de Φpl y las mediciones de transmitancia y reflectancia difusa. Los valores resultantes de Φpl, σa(λex), partes imaginarias del índice de refracción y B calculados de estas muestras se dan dependiendo del número de moléculas de tinte incorporadas por partícula. Finalmente, se define una eficiencia de luminiscencia (LE) sin unidades que permite la comparación directa de eficiencias de luminiscencia de partículas con diferentes tamaños.

En las últimas décadas, las nanopartículas (NP) y micropartículas (MP), teñidas o codificadas con diferentes tipos de luminóforos moleculares y nanocristalinos, se han utilizado cada vez más en las ciencias de la vida y de los materiales. Las aplicaciones típicas van desde reporteros ópticos para ensayos de fluorescencia y sistemas de bioimagen y administración de fármacos, pasando por etiquetas de autenticación imprimibles y plataformas basadas en perlas para citometría de flujo, microscopía de fluorescencia e inmunoseparación, hasta sensores de partículas y herramientas de calibración para diferentes métodos de fluorescencia, en particular para citometría de flujo1. ,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. La mayoría de los métodos de fluorescencia que explotan NP y MP emisores, como la espectroscopia de fluorescencia, la microfluorometría, la microscopía de fluorescencia y la citometría de flujo, miden solo las intensidades de fluorescencia relativas específicas del instrumento14. La comparación confiable de mediciones de fluorescencia entre diferentes instrumentos y diferentes laboratorios requiere una calibración del instrumento para determinar y considerar las contribuciones de señal específicas del instrumento, como la respuesta espectral dependiente de la longitud de onda del canal de detección del instrumento, que afecta los espectros de emisión medidos15,16. Para la cuantificación de, por ejemplo, analitos o la comparación de diferentes muestras fluorescentes con diferentes técnicas de fluorescencia, comúnmente se realiza una calibración relativa de la escala de intensidad de fluorescencia usando soluciones de fluoróforos de concentraciones conocidas, propiedades de luminiscencia y, en particular, espectros de emisión que coinciden estrechamente con los de los muestra utilizando la misma configuración del instrumento que se aplicó para la medición de la muestra17. Esto es sencillo para muestras luminiscentes transparentes, por ejemplo, aplicaciones de detección o la cuantificación de luminóforos con técnicas de separación cromatográfica como la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) con detección de fluorescencia, pero es un desafío para los sistemas de dispersión de luz. Sin embargo, la mayoría de las dispersiones de NP y MP fluorescentes ampliamente utilizadas dispersan la luz de excitación, dependiendo de su tamaño, el índice de refracción y el entorno de las partículas. Esto puede afectar su caracterización fluorométrica y, en particular, las mediciones de sus características de absorción con espectrofotómetros y espectrofluorómetros comunes diseñados para la medición de muestras transparentes.

La importancia de cuantificar los objetos luminiscentes dispersos, por ejemplo para la citometría de flujo utilizada para el análisis de sangre, células y biomarcadores en áreas fuertemente reguladas como el sector de la salud y el diagnóstico médico reconocido hace 30 años, exigió el establecimiento de una escala de intensidad de fluorescencia comparable y estandarizable18. Esto inició el desarrollo de las llamadas escalas relativas MESF (número de moléculas de fluorocromos solubles equivalentes)19,20 y ERF (fluoróforos de referencia equivalentes)11 para medir y cuantificar la intensidad de fluorescencia de objetivos fluorescentes en citometría de flujo con la ayuda de luminiscentes. perlas de calibración21. Este concepto también se utiliza en microscopía de fluorescencia. Las escalas MESF y ERF se basan en la comparación de las intensidades integrales de fluorescencia de una dispersión de partículas teñidas de tinte con una distribución de tamaño estrecha de concentración conocida con una solución de un fluoróforo molecular de concentración conocida con un espectro de emisión muy similar. De este modo, la intensidad de fluorescencia de las perlas se expresa en términos de la intensidad de este fluoróforo molecular y la determinación cuantitativa de los parámetros espectroscópicos clave, sección transversal de absorción (σa(λ)) y fotoluminiscencia o rendimiento cuántico de fluorescencia (Φpl) del tinte. Se evitan las cuentas manchadas. Mientras tanto, estos conceptos de calibración de intensidad relativa han llevado a la amplia disponibilidad de una multitud de perlas de calibración con valores MESF o ERF asignados adaptados a las propiedades ópticas de las etiquetas fluorescentes típicas aplicadas en citometría de flujo. Además, la confiabilidad y precisión de estos conceptos se han evaluado para diferentes tipos de perlas de calibración teñidas con núcleo o marcadas con fluoróforos mediante varias comparaciones entre laboratorios de grupos de expertos y diferentes citómetros de flujo en las últimas décadas. De este modo, se han examinado las limitaciones causadas, por ejemplo, por la eficiencia de fluorescencia dependiente del microambiente y la concentración del colorante de la mayoría de los fluoróforos y diferentes diseños de instrumentos, incluidos los componentes ópticos utilizados para los citómetros de flujo22,23,24,25,26.

Como alternativa a una escala de intensidad de fluorescencia relativa, se puede realizar y utilizar para la cuantificación una escala absoluta basada en las propiedades espectroscópicas fundamentales σa(λex) y Φpl21,27, la relación entre el número de fotones emitidos y el número de fotones absorbidos28. por ejemplo, en estudios de imagen29. El producto de estas dos cantidades se denomina brillo (B) y controla el tamaño de cada señal detectada fluorométricamente desde el lado de la muestra. Este concepto se ha sugerido para moléculas individuales30, pero no para dispersiones de partículas luminiscentes que dispersan la luz, ya que la dispersión de la luz hace que la determinación de σa(λex) y Φpl sea más difícil y requiere instrumentación especial. σa(λex) de dispersiones de partículas se puede derivar de la teoría del transporte de radiación, utilizando un espectrofotómetro equipado con una esfera integradora para medir la transmitancia dependiente de la longitud de onda y la reflectancia difusa (Rd). El Φpl de muestras luminiscentes que dispersan la luz solo se puede determinar ópticamente con precisión integrando la espectroscopia de esferas27,31 y el creciente interés en tales mediciones inició un renacimiento de la espectroscopia de esferas integradoras en la última década32,33,34,35,36,37. Para partículas con tamaños inferiores a 100 nm, donde la dispersión es más o menos isotrópica, también hay muy pocos informes sobre métodos espectroscópicos relativos alternativos, que son, sin embargo, más tediosos y propensos a errores. Esto incluye una corrección de dispersión basada en restas de la absorbancia medida en la longitud de onda de excitación38, la adición de dispersores al estándar de rendimiento cuántico de fluorescencia empleado para la determinación relativa de Φpl, haciendo coincidir así las características de dispersión de la muestra y el estándar39, y la determinación de la Función dieléctrica compleja de partículas cargadas de tinte y consideración de la influencia de la dispersión de Mie40.

Con el objetivo de establecer una escala B para la caracterización de las propiedades relevantes de la señal de las perlas luminiscentes, a continuación mostramos cómo se puede obtener B de dispersiones de dispersión de luz de partículas luminiscentes con una única configuración de esfera integradora diseñada a medida y calibrada de forma trazable. . Esta configuración única permite tanto la determinación absoluta de los valores de Φpl como las mediciones de los espectros Rd, transmitancia colimada (Tc) y transmisión difusa (Td) de dispersiones de partículas27. La determinación de los valores de B se demuestra para dispersiones de partículas de poliestireno (PSP) monodispersas de 100 nm y 1 µm de tamaño, cargadas con diferentes concentraciones de moléculas de Rojo Nilo e Itrybe, elegidas para variar en su comportamiento solvatocrómico y superposición espectral entre sus bandas de absorción y emisión. (desplazamiento de Stokes) y, por tanto, reabsorción dependiente de la concentración41. Nile Red es una sonda de polaridad empleada con frecuencia42,43 y antes utilizamos partículas de poliestireno cargadas con Itrybe y Nile Red para estudios de carga de tinte41,42 y como sonda NIR específica de tumores44 o para la codificación de células basada en la vida útil45. En esta publicación, reevaluamos los valores B previamente determinados de dichas perlas teñidas de tinte42 y proporcionamos la parte imaginaria del índice de refracción. Además, los valores de B y eficiencia de los datos medidos de σa(λex) y Φpl se dan dependiendo del número de moléculas de tinte incorporadas por partícula.

Los procedimientos experimentales utilizados para la tinción con tinte de PSP funcionalizada con carboxilo de diferentes tamaños y la determinación absoluta de los valores de Φpl con nuestra configuración de esfera integradora diseñada a medida que permite mediciones de los espectros de fluorescencia, Rd, Tc y Td de suspensiones de partículas han sido parcialmente reportado previamente27,31,41,42,44,46.

La PSP funcionalizada con carboxilo con tamaños de 25 nm, 100 nm y 1 µm se adquirió de Kisker Biotech GmbH. Todas las partículas fueron tratadas ultrasónicamente antes de su uso. Nile Red e Itrybe se obtuvieron de Fluka GmbH y Otava Ltd, respectivamente. Los disolventes tetrahidrofurano (THF), dibutiléter (BOB) y etanol (EtOH) eran de calidad espectroscópica y se adquirieron en Merck. Todos los tintes y disolventes se utilizaron tal como se recibieron.

Para mediciones resueltas espectralmente en la región de longitud de onda de aproximadamente 350 a 1000 nm, se utilizó una configuración de esfera integradora diseñada a medida y calibrada de forma trazable que permitía la libre elección de la longitud de onda de excitación27. Esta configuración previamente informada31,46 consistía en una lámpara de xenón de 450 W, acoplada a un único monocromador con rejillas de 1200 L/mm encendidas a 330 nm, 500 nm y 630 nm y una esfera integradora con un diámetro de aproximadamente 15 cm, recubierta con Spectraflect (Labsphere GmbH; reflectividad esférica de aproximadamente el 97 % en vis/NIR) como compartimento de muestra. La esfera integradora se acopló con un haz de fibras de cuarzo a un espectrógrafo de imágenes (Shamrock 303i, Andor Technology PLC), equipado con rejillas de 600 L/mm, encendidas a 500 nm y 750 nm que estaba conectado a un Peltier enfriado (183 K) adelgazado. Dispositivo acoplado con carga de agotamiento profundo iluminado en la parte posterior (matriz CCD; 1024 × 256 píxeles). La fibra óptica estaba protegida de los reflejos directos con varios deflectores para garantizar la detección únicamente de radiación difusa. Para tener en cuenta sus fluctuaciones y las mediciones de la transmitancia colimada, se implementaron dos detectores de trampa de silicio diseñados a medida y refrigerados por Peltier47 en la configuración de la esfera integradora.

Para realizar múltiples configuraciones de medición o condiciones de iluminación para las mediciones resueltas espectralmente de emisión, reflexión y transmitancia y una iluminación indirecta de la muestra, la esfera integradora se equipó con varios puertos para el acoplamiento de luz a la esfera y el montaje de la muestra. Para la determinación absoluta de Φpl, la muestra se montó en el centro dentro de la esfera integradora utilizando un soporte de cubeta recubierto con Spectraflect de diseño personalizado. La luz de excitación se enfocó con dos espejos parabólicos fuera del eje en el centro (posición de la muestra) de la esfera integradora, generando así imágenes de la ranura de salida del monocromador de excitación en el centro de la cubeta (consulte la figura complementaria S1) 31. La potencia radiante que llegaba a la muestra se ajustaba con una apertura situada delante de la esfera integradora. Para el posicionamiento preciso de las células dentro de la esfera integradora, además del soporte de la cubeta, se utilizó un pequeño láser de HeNe. La luz láser reflejada desde la interfaz vidrio/aire de la ventana de la cubeta se midió fuera de la esfera integradora.

Para mediciones de transmisión y reflexión, se requiere un haz colimado. Por lo tanto, la configuración de la esfera integradora se modificó ligeramente. El espejo parabólico fuera del eje 2 (ver Información complementaria (SI), Fig. S1) fue reemplazado por un espejo plano. De este modo, el tamaño del punto para las mediciones de reflexión y transmisión podría ajustarse con aberturas detrás de la rendija de salida abierta del monocromador de excitación. Se colocaron soportes de muestras diseñados a medida para películas delgadas y celdas de pequeño volumen delante o detrás de la esfera integradora. Las celdas fueron diseñadas para encajar exactamente en los puertos de la esfera integradora. El espesor típico de la muestra para mediciones de transmisión y reflexión osciló entre 200 µm y 1 mm con un diámetro de 2,54 cm.

Los espectros de absorción de las soluciones transparentes de los tintes Nile Red y los tintes liberados de la PSP teñida con tinte tras la adición de THF se midieron con un espectrofotómetro Cary5000 UV-Vis-NIR utilizando celdas de cuarzo de 1 cm de Hellma.

Las mediciones dinámicas de dispersión de luz para la determinación del tamaño de partículas se realizaron con el Zetasizer de Malvern.

Las PSP carboxiladas comerciales se tiñeron con Nilo Red e Itrybe mediante un procedimiento de hinchamiento previamente descrito27,41,42. En resumen, Nile Red e Itrybe se disolvieron en THF en concentraciones de 0,1 a 5 mmol/L. Se añadieron 100 µl de la solución que contenía colorante a 600 µl de una suspensión acuosa de PSP (3 mg/ml). Se incubaron PSP de 25 nm durante 30 minutos, mientras que se incubaron PSP de 100 nm y 1 µm durante 1 h. Luego, se añadieron 800 µL de agua y la suspensión se centrifugó (PSP 1 µm (5.000 g, 10 min) y PSP 100 nm (15.000 g, 40 min) en una centrífuga Eppendorf 5415D, PSP 25 nm (75.000 g, 45 min). ) en una centrífuga Beckman Coulter Avanti J-20 XP. Las PSP teñidas se lavaron dos veces y se resuspendieron en agua bidestilada.

El número de moléculas de tinte incorporadas por partícula se determinó fotométricamente después de disolver las partículas mediante la adición de THF48. En resumen, las PSP teñidas se centrifugaron, se eliminó el sobrenadante y se disolvió en THF. La concentración de colorante liberada a partir de 3 mg de PSP se calculó a partir de mediciones de absorbancia y el coeficiente de absorción molar, determinado en THF en presencia de 0,1% en peso de poliestireno disuelto. La concentración másica de poliestireno se determinó secando y pesando 1 ml de la suspensión acuosa y el número de PSP por mg se determinó considerando el volumen de partículas y la densidad del PS (1050 kg/m3).

Nuestro procedimiento de adquisición de datos para la determinación del brillo y la eficiencia de las partículas basado en espectroscopia de esfera integradora sigue la presentación esquemática ilustrada en la Fig. 1. Para la determinación de los valores de Φpl, el (\({q}_{\mathrm{p}}^ absorbido Se determinan {\mathrm{abs}}\)) y el flujo de fotones emitidos (\({q}_{p}^{pl}\)) (consulte la sección sobre “Determinación de los rendimientos cuánticos de fotoluminiscencia”). En un siguiente paso, se realizaron mediciones de reflexión y transmisión (consulte la sección sobre "Medidas de reflexión y transmisión"), obteniendo Rd, Tt, Td y Tc. Con estos parámetros determinados experimentalmente, Φpl se puede calcular directamente (consulte la sección "Determinación de los rendimientos cuánticos de fotoluminiscencia"). Resolviendo la teoría del transporte de radiación, se pueden calcular la dispersión (μs), los coeficientes de absorción (μa) y el factor de anisotropía de dispersión (g) (consulte la sección sobre el cálculo de μa, μs y g). Al implementar la teoría de Mie, también se determinan el número de partículas por unidad de volumen (NP), el radio de la partícula (rP) y la parte imaginaria del índice de refracción (n2) (sección sobre “Determinación de las propiedades de las partículas”). Los valores resultantes de σa(λex) y Φpl se utilizan finalmente para calcular B y la eficiencia de luminiscencia (LE).

Diagrama de flujo de adquisición y análisis de datos: flujo de fotones absorbidos (\({q}_{\mathrm{p}}^{\mathrm{abs}}\)) y emitidos (\({q}_{p}^{ pl}\)). Reflectancia difusa (Rd), transmitancia total (Tt), difusa (Td) y colimada (Tc), coeficientes de dispersión (μs), coeficientes de absorción (μa), factor de anisotropía de dispersión (g), rendimiento cuántico de fluorescencia (Φpl), número de partículas por unidad de volumen (NP), radio de partícula (rP), parte imaginaria del índice de refracción (n2), sección transversal de absorción (σa), eficiencia de absorción (Qabs) y eficiencia de luminiscencia de partículas (LE).

La respuesta óptica de una esfera integradora depende de su configuración (portamuestras, deflector, tamaños de puertos, etc.). Para una esfera ideal, el factor de aumento M(λ) viene dado por49:

\(\overline{\rho } (\lambda )\) representa la reflectividad promedio dependiente de la longitud de onda de la superficie de la esfera que depende de las áreas del puerto Ai con sus correspondientes reflectividades \(\rho_{i} (\lambda )\) y el área de superficie de la esfera AS y la reflectividad ρS(λ), respectivamente, (fi = Ai/AS). El flujo radiante incidente ϕe se refleja difusamente desde un área de superficie con una reflectancia ρ0(λ) (ver Ec. 1, Fig. 2). El flujo radiante resultante ϕS que llega a la superficie de la esfera y genera la señal del detector I depende de ϕe y M(λ):

Configuraciones de la configuración de la esfera integradora, consulte también la figura complementaria S1 y los flujos de luz correspondientes (eq. S3) empleados para (a) mediciones \({\Phi }_{pl}\), (b) mediciones Rd, y (c, d) la medición de Tt, Td y Tc.

Teniendo además en cuenta la superficie del detector AD y la capacidad de respuesta espectral del sistema de detección s(λ), I puede escribirse como:

Por lo tanto, cada cambio de la configuración de la esfera integradora (ver también Fig. 2) o superficie, por ejemplo, el intercambio de una muestra y una referencia, cambia la respuesta de la configuración de la esfera integradora y debe ser considerado.

El rendimiento cuántico de fotoluminiscencia se define como el cociente del número de fotones absorbidos (Nabs) y el número de fotones emitidos (Nem) por una muestra27,42,46,50, consulte la ecuación. (4).

\({\Phi }_{pl}\) de muestras dispersas como las suspensiones de nuestra PSP teñida con tinte solo se puede determinar de manera confiable mediante la integración de espectroscopia de esfera51. Esto implica la determinación del flujo de fotones absorbidos (\({q}_{p}^{abs}({\lambda }_{\text{ex}})\)) y el flujo de fotones emitidos (\({q }_{p}^{em}({\lambda }_{\text{em}})\)) de la muestra (ver Ec. (5) y Fig. 2a))31,46 con una configuración de esfera integradora .

El flujo de fotones emitidos se deriva del espectro de emisión en blanco y espectralmente corregido de la muestra (Ix(λem)) integrado en la banda de emisión. El flujo de fotones absorbidos se calcula a partir de la diferencia entre la luz de excitación transmitida obtenida con el blanco (Ib(λex)) y la muestra (Ix(λex)), dentro de la región de longitud de onda del ancho de banda de excitación Δλ.

Las mediciones de reflexión y transmisión se realizaron con la misma configuración de esfera integradora que las mediciones de rendimiento cuántico. La muestra se rellenó en celdas cilíndricas de cuarzo de pequeño volumen con un espesor de 1 mm. Para cada señal medida registrada de un estándar (índice estándar) o muestra (índice S) o esfera vacía (índice vacío) se realizó una medición de referencia para tener en cuenta los cambios del factor de aumento M(λ). Para el cálculo de la reflectancia y la transmitancia, las señales resueltas espectralmente que determiné, la esfera integradora se integraron en el rango espectral de la luz de excitación \(E = \int\limits_{{\lambda_{ex} - \Delta \lambda }}^ {{\lambda_{ex} + \Delta \lambda }} {I(\lambda_{{{\text{ex}}}} )} d\lambda_{{{\text{ex}}}}\). La detección con resolución espectral tiene la ventaja de que también se pueden investigar muestras fuertemente fluorescentes. Las esferas integradoras equipadas únicamente con tubos fotomultiplicadores o fotodiodos no pueden distinguir entre luz de excitación/incidencia y luminiscencia desplazada al rojo y, por lo tanto, no son adecuadas para la reflectancia y transmisión de materiales luminiscentes.

Para las mediciones de Rd, la muestra se montó con soportes de muestra especiales en la parte posterior de la esfera integradora (Puerto R Fig. 2b)), luego se calculó Rd con respecto a los estándares de reflectancia difusa certificados por NIST de acuerdo con:

RStd(λ) es igual al valor Rd certificado del estándar de reflectancia, Ee(λ) y ERef(λ) representan la señal del detector con iluminación de muestra directa e indirecta, respectivamente. ED indica una medición oscura para eliminar una compensación de señal. Los subíndices S y Std representan mediciones de la muestra y el estándar montado en el puerto de reflectancia, respectivamente. En las mediciones se incluyó el primer reflejo de la superficie de vidrio de la muestra (RFresnel).

Para cada medición de transmisión, la muestra se montó en el puerto de entrada de la esfera integradora. La radiación transmitida (Ttotal) se puede separar en dos partes, la radiación transmitida directamente o colimada (Tc) y la radiación transmitida de forma difusa (Td):

Los fotones transmitidos de forma colimada pasan por la muestra sin interacción y, por tanto, tienen la misma dirección de propagación que los fotones incidentes, mientras que los fotones transmitidos de forma difusa se dispersan al menos una vez. La transmitancia total se midió con la configuración de esfera integradora que se muestra en la Fig. 2c) y se calculó con la ecuación. (8). Con la misma configuración pero con un puerto abierto en la parte posterior de la esfera integradora (puerto R), se puede determinar la transmitancia difusa, consulte la Fig. 2d) y la ecuación. (8).

En principio, la Tc se puede calcular a partir del flujo de fotones transmitidos total y difuso (Ec. 7). Pero el puerto R abierto para mediciones de Rd provoca pérdidas de fotones dispersos de forma difusa, lo que lleva a un cálculo incorrecto de Tc. Estos errores se correlacionan con el tamaño del puerto R y el diámetro de la esfera integradora. Por lo tanto, se utilizó un detector de trampa para medir Tc. Nuestro detector de trampa consta de tres fotodiodos de silicio dispuestos en una geometría de 60° para atrapar la luz incidente. Este detector de trampa con una apertura de 0,5 mm se colocó a una distancia de 1,5 m detrás de la muestra para reducir el ángulo sólido de los fotones dispersos y emitidos que contribuyen a las mediciones de Tc. Luego se calculó Tc a partir de las señales del detector de trampas ITrap:

En medios fuertemente dispersantes, la propagación de la luz puede describirse mediante la teoría del transporte de radiación:

La distribución de la luz dentro de una muestra está definida por L (r, s), que representa la radiancia vectorizada en el punto r en la dirección de propagación s (ilustrada en el SI en la Fig. S2). Para facilitar la lectura aquí descuidamos las notaciones vectoriales. L(r,s) depende del número de partículas absorbentes y dispersantes en la muestra descrita por µa y µs, los coeficientes de absorción y dispersión. p(s, \(\tilde{s}\) λ) es la función de fase para procesos de dispersión y \(d\Omega\) es el ángulo sólido. S(r,s) es un término fuente para la fluorescencia emitida isotrópicamente en la muestra en el punto r y depende de la densidad de los fluoróforos excitados y L(r,s) en la posición del fluoróforo. La propagación de la luz se ilustra en el SI en la Fig. S2. Con el conocimiento de los tres parámetros Tt, Tc (o Td) y Rd, la teoría del transporte de radiación se puede resolver con enfoques como la teoría de Kubelka-Munk, los métodos de Monte Carlo y el método de suma y duplicación inversa (iAD) para calcular la parámetros específicos de la muestra µa, µs y g52,53,54,55,56. g es el coseno medio de la función de fase de dispersión, que puede calcularse a partir de la teoría de Mie. Normalmente, la función de fase se reduce a un modelo más simplificado como la función de fase de Henyey-Greenstein (HG) o la función de fase de Gegenbauer Kernel57,58. Para resolver la teoría del transporte de radiación y determinar los parámetros µa(λ), µs(λ) y g(λ) dependientes de la longitud de onda, utilizamos el método iAD de libre acceso de Prahl et al.52. Aquí ya está implementada la función de fase HG, que se adapta mejor a la función de fase de dispersión de las partículas de poliestireno. Para muestras luminiscentes, se debe eliminar el término fuente S(r,s) que depende de σa(λex) y Φpl del luminóforo. Además, se debe considerar la primera reflexión de la radiación incidente.

Con nuestro enfoque, detectamos los flujos de fotones transmitidos y reflejados resueltos espectralmente (consulte la sección sobre "Medidas de reflexión y transmisión"). Por lo tanto, podríamos separar los fotones emitidos de la luz incidente/transmitida y calcular la reflexión y transmitancia sin perturbaciones. Esto permite la solución de la Ec. (9) sin tener en cuenta el término fuente de la fluorescencia (S(r,s)).

Los coeficientes de dispersión y absorción determinados a partir de mediciones de reflexión y transmisión y la solución de la teoría del transporte de radiación son parámetros de muestra eficaces y no revelan directamente información sobre las propiedades de una sola partícula. Si se conoce el número de partículas por unidad de volumen (Np), las secciones transversales de absorción y dispersión (\({\upsigma }_{\mathrm{a},\mathrm{s}}(\uplambda ))\) pueden ser directamente calculado a partir del coeficiente de absorción \({\mu }_{a}(\lambda )\) calculado mediante el método iAD.

Para muestras polidispersas, esta sección transversal es el promedio de la distribución de tamaños. Además, si también se conoce el radio de la partícula rp, se pueden determinar las eficiencias de dispersión y absorbancia (Qa,s \((\lambda )\)). Qa,s \((\lambda )\) se define en la ecuación. (12) como la relación entre la sección transversal correspondiente y la sección transversal física de una partícula.

La determinación de Np puede resultar bastante complicada. Conociendo el rp y su distribución, se puede secar una cantidad de muestra definida y se puede calcular el número de partículas a partir de la masa resultante y la densidad del material de partículas. Para este método se requiere una cantidad de muestra suficientemente grande. Desafortunadamente, las partículas secas a menudo no se redispersan fácilmente. Además, se puede utilizar un citómetro de flujo o un análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) calibrado para determinar la concentración de partículas, pero para estos enfoques las muestras a menudo deben diluirse fuertemente. rp también se puede determinar, por ejemplo, mediante métodos de dispersión como la dispersión de luz dinámica o estática (DLS, SLS), que analizan la fluctuación de la intensidad de la luz dispersa o la distribución espacial de la intensidad. También se pueden utilizar, por ejemplo, dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) o NTA59,60 o técnicas basadas en imágenes como la microscopía electrónica de transmisión y barrido (TEM, SEM). Estos últimos métodos basados ​​en imágenes, que miden partículas individuales, pueden llevar mucho tiempo, ya que es necesario medir un número estadísticamente relevante de partículas para determinar con precisión la distribución de tamaños.

Un enfoque sencillo que no necesita ninguna otra instrumentación es la descripción teórica de las propiedades de las partículas ópticas mediante la rigurosa teoría de la dispersión (teoría de Mie), es decir, la solución de la ecuación de onda para condiciones de contorno esféricas. σs(λ), σa(λ), p(λ) y g(λ) pueden predecirse teóricamente y adaptarse a la solución de la teoría del transporte de radiación.

Las secciones transversales (σa,s) se calculan a partir de los parámetros fundamentales an y bn:

con y = πmd/λmed y x = πd/λmed y las funciones Ricatti-Bessel ψn y ζn Estos parámetros fundamentales dependen del índice de refracción relativo complejo m entre la partícula (np) y el medio (nmed), el radio de la partícula (rP ), y la longitud de onda en el medio exterior λmed = λ/nmed. Usamos los códigos de Mätzler61 y los modificamos para calcular los coeficientes de dispersión y absorción dependientes de la longitud de onda. Finalmente, generamos un algoritmo de ajuste de mínimos cuadrados basado en la teoría de Mie y del transporte de radiación. Los parámetros de entrada para esta rutina son \({\mu }_{a}(\lambda )\), \({\mu }_{s}(\lambda )\), \({g}_{s}\ left(\lambda \right),\) y las propiedades del material, por ejemplo, los índices de refracción del disolvente y la partícula62. Como parámetros libres para el procedimiento de ajuste se utilizaron no sólo Np y rp sino también la anchura de la función de distribución de tamaño para considerar la polidispersidad de la dispersión de perlas. El procedimiento de ajuste finalmente proporciona rp, Np y la parte imaginaria del índice de refracción (n2) de las partículas. Alternativamente, se puede determinar la parte real del índice de refracción si se conoce el tamaño de las partículas63.

Para determinar con precisión rp mediante el ajuste de una dependencia característica de la longitud de onda de \({\mu }_{s}(\lambda )\), que exhibe un comportamiento oscilatorio (resonancias de Mie). Esto depende del disolvente, el material de las partículas y el tamaño, así como de la región de longitud de onda investigada. Por ejemplo, para partículas de poliestireno con un diámetro del orden de 1 µm y mayores, dispersas en agua, se pueden determinar rp y Np. Para partículas que no presentan una dependencia característica de la longitud de onda de µs(λ), es necesario conocer el tamaño de partícula para determinar el número de partículas por unidad de volumen. Esto es similar a los métodos presentados anteriormente basados ​​en Tc.64.

Las partes real e imaginaria del índice de refracción complejo \({n\left(\lambda \right)={n}_{1}\left(\lambda \right)+{\text{i}}\hspace{0.17 em}{n}_{2}\left(\lambda \right)}\) de un material están vinculados por las llamadas relaciones Kramers-Kronig (KK). Por ejemplo, \({n}_{1}\left(\lambda \right)\) está relacionado con \({n}_{2}\left(\lambda \right)\) por

Aquí, \(P\int\) denota la integra del valor principal de Cauchy y \(\lambda\) la longitud de onda en el vacío. Tenga en cuenta que la integral se toma en todas las longitudes de onda (o frecuencias) desde cero hasta el infinito. La parte real del índice de refracción está influenciada por el espectro de absorción en todas las demás longitudes de onda.

El índice de refracción complejo de una PSP que contiene un tinte en una concentración molar intrapartícula \({c}^{\text{dye}}\) viene dado por

El incremento de la parte imaginaria está relacionado con el coeficiente de extinción molar de los colorantes Rojo Nilo e Itrybe por

La unidad para los incrementos del índice de refracción \(\widetilde{\alpha }\left(\lambda \right), \widetilde{\gamma }\left(\lambda \right)\) es la de una concentración molar inversa—L/ moles. Suponiendo que la matriz (es decir, poliestireno) es casi no absorbente en el rango de longitud de onda considerado aquí, establecemos \({n}_{2}^{\text{matrix}}\left(\lambda \right) =0\). Bajo el supuesto de que fuera de un rango de longitud de onda \(\left[{\lambda }_{a},{\lambda }_{b}\right]\) (por ejemplo, el rango visible) la absorción del material de la matriz poliestireno y el tinte es similar, la parte real del incremento del índice de refracción se puede calcular de acuerdo con

Si los espectros fuera del rango \(\left[{\lambda }_{a},{\lambda }_{b}\right]\) no coinciden, pueden aparecer términos adicionales constantes o de dispersión normal con signos positivos o negativos. ocurren en \(\widetilde{\alpha }\left(\lambda \right)\).

Para la evaluación numérica, utilizamos espectros medidos del coeficiente de extinción molar \(\varepsilon \left(\lambda \right)\) para obtener \(\widetilde{\gamma }\left(\lambda \right)\). La integral en la ecuación. (18) luego se evaluó en un rango \(\left[{\lambda }_{a},{\lambda }_{b}\right]\) que cubría el pico principal del espectro. Para NR, esto fue de 300 a 700 nm. Los espectros se interpolaron a un tamaño de paso de 0,5 nm y la integral (KK) se evaluó numéricamente65. El espaciado de la cuadrícula de longitud de onda de los datos \(\widetilde{\alpha }\left(\lambda \right)\) resultantes se incrementó (reducción de resolución) al valor deseado (por ejemplo, 5 nm) para los cálculos de dispersión de Mie y la comparación con los espectros medidos. .

Para obtener el índice de refracción complejo para los cálculos de Mie, determinamos la concentración promedio de carga de tinte por partícula mediante mediciones fotométricas de los espectros de absorción de las moléculas de tinte liberadas tras la disolución de las partículas con THF (consulte la sección "Determinación de las propiedades de las partículas") y la ecuación. (18).

Para evaluar nuestros procedimientos y algoritmos de medición, se utilizaron diferentes dispersiones acuosas de microesferas de poliestireno monodispersas y casi no absorbentes con diferentes diámetros de partículas y concentraciones definidas. Se muestran ejemplos en la Fig. 3 y en el SI en las Figs. S3 (d ≈ 1 µm) y S4 (d ≈ 2,5 µm). Aquí determinamos Tt, Tc y Rd de una dispersión de PSP con un diámetro de ca. 1250 nm. La suma de Tt y Rd es igual a 0,95 debido a pequeñas pérdidas por dispersión que dependen de la muestra y de la geometría de la esfera integradora (ver Fig. 3a)). Estas pérdidas pueden diferir para muestras con diferentes propiedades de dispersión y espesores de muestra, pero Prahl et al.52 las consideran en la rutina iAD. Si no se compensan completamente, estas pérdidas dan como resultado una compensación en el coeficiente de absorción. En consecuencia, la teoría del transporte de radiación con Tt, Tc y Rd como parámetros de entrada se resolvió para todas las muestras para determinar el coeficiente de dispersión dependiente de la longitud de onda (μs(λ), Fig. 3b)) y el factor de anisotropía dependiente de la longitud de onda (g( λ), figura 3c)). Luego, estos resultados se ajustaron a la teoría de Mie para determinar Np y rp; este último se validó adicionalmente con mediciones DLS (Fig. 3d que arroja rp, DLS = 1291 nm. El procedimiento de ajuste produce una buena concordancia entre la solución del transporte de radiación y la teoría de Mie). y el radio de partícula resultante y las concentraciones de partículas confirman la idoneidad de nuestro enfoque.

Dispersión de partículas de poliestireno sin teñir con aproximadamente 1,25 µm de diámetro. (a) Reflectancia difusa (Rd, triángulos), transmitancia total (Tt, triángulos) y colimada (Tc, círculos llenos) y suma de Rd y Tt (cuadrados llenos). (b) Coeficiente de dispersión (μs) calculado a partir de la teoría del transporte de radiación (cuadrados sólidos) y la teoría de Mie (línea roja). (c) Factor de anisotropía g calculado a partir de la teoría del transporte de radiación (cuadrados sólidos) y la teoría de Mie (línea roja). (d) Función de distribución de tamaño determinada con DLS (círculos sólidos, línea negra) y teoría de Mie (línea roja).

Para evaluar nuestro método con partículas absorbentes y luminiscentes, se prepararon y caracterizaron sistemas modelo cuasi monodispersos como se describe en la sección "Métodos". Nos centramos en partículas con tamaños de 25 nm, 100 nm y 1 µm, estas últimas exhiben fuertes comportamientos de dispersión anisotrópica (g > 0). Los espectros de emisión y absorbancia normalizados de dispersiones acuosas de estos PSP de diferentes tamaños cargados con Nile Red e Itrybe se muestran en el SI de la Fig. S5. Debido a la tinción con tinte de las partículas mediante un procedimiento de hinchamiento previamente optimizado evaluado, por ejemplo, microscopía, se puede suponer que las moléculas de tinte están distribuidas homogéneamente dentro de las partículas y que la forma esférica de las partículas se conserva en el proceso.12,41 ,42,44 Esto permite un análisis de datos basado en la teoría de Mie, como con las partículas sin teñir discutidas anteriormente. Los espectros de absorbancia y emisión de la PSP cargada con Itrybe se amplían en comparación con la molécula original en etanol, pero los respectivos máximos de absorción y emisión coinciden. En el caso del Rojo Nilo solvatocrómico, las bandas de absorbancia y emisión de la PSP teñida con Rojo Nilo se desplazan hacia el rojo al disminuir el tamaño de la PSP, lo que apunta a un microambiente cada vez más polar al que se enfrentan las moléculas de tinte con un tamaño de PSP reducido y, por lo tanto, una mayor relación superficie-volumen. relación. Las \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) correspondientes de dispersiones acuosas de PSP cargadas con rojo Nilo e Itrybe en función del tamaño de la PSP y la concentración de carga, es decir, la distancia promedio entre tintes, se muestran en Fig. 4. Esta figura revela tendencias opuestas para el tamaño de partícula y la carga de tinte \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) de ambos tintes. Como se muestra en el panel izquierdo de la Fig. 4, los valores de \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) de PSP teñida de rojo Nilo disminuyeron al disminuir el tamaño de PSP y aumentar la relación superficie-volumen. Por el contrario, para la PSP que contiene moléculas de Itrybe, \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) disminuyó al aumentar el tamaño de partícula (panel derecho de la Fig. 4. Para ambos tintes, un aumento en la concentración de carga de tinte resultó en una disminución de \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) (ver también SI, Fig. S7). Atribuimos estas tendencias a (1) la influencia del entorno de partículas polares, particularmente en el caso de la tinte de transferencia de carga Nilo Red, cuya fluorescencia se sabe que se apaga mediante interacciones de enlaces de hidrógeno y polaridad como se desprende también del comportamiento de emisión solvatocrómica de Nile Red (ver SI, Fig. S5), (2) interacciones tinte-tinte, y (3) procesos de transferencia de energía entre moléculas de tinte en el PSP. Los dos últimos factores están respaldados por la dependencia de \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) de la concentración de carga de tinte (ver Fig. 4 y SI , Fig. S7) 66,67,68,69,70. µa(λ) y µs(λ) de las PSP dispersas cargadas con tinte de 1 µm y 100 nm determinadas por transporte de radiación y teoría de Mie se muestran en la Fig. 5. Para Las partículas de tamaño de 25 nm, las contribuciones de dispersión, eran demasiado pequeñas para usarse para la cuantificación y representan el límite de tamaño físico para nuestro estudio y desarrollo de métodos. Para el ajuste de µa(λ) y µs(λ), consideramos la contribución de las moléculas de tinte a la función dieléctrica de la matriz de partículas aumentando la parte imaginaria del índice de refracción. En un primer paso, se utilizó n2 como variable libre y se asumió que la matriz de partículas está cargada homogéneamente con moléculas de tinte. Los valores de σa(λ) resultantes se muestran en la Fig. 6. Los valores de Np y rp resultantes también se usaron para la determinación de σa(λ) a partir de µa(λ) calculado a partir de la teoría del transporte de radiación. Para los tamaños de partículas y las concentraciones de tinte utilizados aquí, la determinación directa de σa(λ) a partir de los cálculos de Mie y los cálculos que utilizan la teoría del transporte de radiación concuerdan como se muestra en la Fig. 5.

Rendimientos cuánticos de fotoluminiscencia de PSP de 1 µm (círculos), 100 nm (cuadrados) y 25 nm (triángulos) cargados con Nile Red41 (izquierda) e Itrybe (derecha) dependiendo de la distancia media entre las moléculas de tinte. Las líneas son sólo una guía para la vista. Las líneas discontinuas indican el máximo. \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) en solución de los colorantes libres, es decir, Itrybe disuelto en etanol y Nilo Red en BOB.

Ejemplo de coeficientes de dispersión calculados (μs, arriba, círculos abiertos) y coeficientes de absorción (μa, abajo, círculos rellenos) a partir de mediciones de reflexión y transmitancia de PSP Nile Red-loaded de 1 μm (izquierda) y 100 nm (derecha). Los ataques de la teoría de Mie se indican con líneas rojas.

Izquierda: secciones transversales de absorción de PSP de 100 nm (arriba) y 1 µm (abajo) cargadas con Rojo Nilo (círculos) e Itrybe (cuadrados) dependiendo del número incorporado de moléculas de tinte por partícula. Derecha: Eficiencia de absorción (Qabs) de la PSP cargada con tinte en función de la parte imaginaria del índice de refracción n2 para PSP de 1 µm (símbolos sólidos) y PSP de 100 nm (símbolos abiertos) cargados con Rojo Nilo (círculos) e Itrybe ( cuadrícula).

Hasta ahora hemos tratado la parte real del índice de refracción y la parte imaginaria como cantidades independientes. En los cálculos de dispersión de Mie, configuramos la parte imaginaria de la PSP teñida con tinte de acuerdo con una línea de absorción del tinte Rojo Nilo o Itrybe, pero asumimos que la parte real es igual a la de la PSP sin teñir. Cuando las ecuaciones. (16)–(18) se aplican a las partículas teñidas, una contribución dependiente de la concentración de tinte a \({n}_{1}\left(\uplambda \right)\) que presenta una dispersión anómala (es decir, localmente , con el índice de refracción disminuyendo con la longitud de onda) que se descuidó hasta ahora y la sección "Materiales y métodos" para más detalles. Repetimos los cálculos de dispersión de Mie incluyendo también el término debido a las relaciones KK para el índice de refracción complejo de las partículas. Los resultados de este modelo físicamente más completo se muestran en el SI de la Fig. S6 para PSP de 1 µm teñida con Rojo Nilo. Generalmente, \({\mu }_{a}\left(\uplambda \right)\) prácticamente no se ve afectado por la contribución de KK a \({n}_{1}\left(\uplambda \right)\), mientras que algunas características espectrales de \({\mu }_{s}\left(\uplambda \right)\) cambiaron notablemente. Dado que \({\mu }_{s}\left(\uplambda \right)\) se utiliza para determinar el tamaño de partícula y la concentración del número de partículas, se introduce un error en este enfoque al omitir el término KK. Para las partículas de 1 µm, estimamos que la incertidumbre correspondiente es de aproximadamente el 5 % para el diámetro medio de las partículas, que en consecuencia está subestimado, y aproximadamente el 10 % para la concentración de partículas, que por lo tanto está sobreestimada, dependiendo del flujo de trabajo exacto de los datos. análisis. Para partículas más pequeñas, el efecto de las relaciones KK en \({\mu }_{\mathrm{s}}\left(\uplambda \right)\) disminuye y puede despreciarse para diámetros ≤ 100 nm.

Como se muestra en el panel izquierdo de la Fig. 6, σa (λ) aumentó linealmente hasta 7 × 104 y 1,8 × 107 incorporaron moléculas de Nilo Red o Itrybe para 100 nm y 1 µm de PSP. El impacto de la carga de tinte en las propiedades efectivas de las partículas, es decir, Qabs y n2, se muestra en el panel derecho de la Fig. 6. Para PSP de 100 nm de tamaño, Qabs es considerablemente más pequeño en comparación con PSP de 1 µm. Una extrapolación muestra que también para concentraciones de carga de tinte más altas, es decir, n2, la eficiencia aumenta linealmente. Para partículas de 1 µm, la relación entre Qabs y n2 ya no es lineal para concentraciones de tinte que exceden las concentraciones utilizadas en este estudio.

El producto de \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) y σa(λ) se puede utilizar para calcular el brillo (B) de una partícula como se hizo antes para el valor B de una molécula de tinte como se muestra en la Fig. 7. Para luminóforos moleculares como las moléculas de tinte, B generalmente se da como el producto de \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) y el coeficiente de absorción decádica molar (ε(λ)) que es relacionado con la fuerza del oscilador del dipolo emisor. A diferencia de las moléculas de tinte, σa(λ) de partículas escala con rp, n2 y \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\). Este último está relacionado con la cantidad de moléculas de tinte incorporadas en la partícula (ver Figs. 4 y 6), las interacciones tinte-tinte y las propiedades específicas del tinte, como la fuerza del oscilador y \({\Phi }_{\mathrm{pl). }}\) en el entorno respectivo. Anteriormente, calculamos el brillo de las partículas a partir del producto del número de moléculas por partícula, el ε correspondiente del tinte determinado en un solvente modelo como BOB y el \({\Phi }_{\mathrm{pl}} medido. \) de la dispersión de partículas (\({{N}_{\mathrm{Dye}}\cdot\upvarepsilon ({\lambda }_{ex})\cdot \Phi }_{\mathrm{pl}}\) )27,71, ver Fig. 7 (panel izquierdo). Esta aproximación, que es válida para partículas pequeñas y bajas concentraciones de carga de colorante, tiene varios inconvenientes. Como se muestra en el SI en la Fig. S5, (1) ε puede depender del entorno del tinte y solo se puede medir en un disolvente que imite el entorno del tinte dentro de la partícula. La imitación implica aquí idealmente una polaridad y un índice de refracción comparables. (2) Para la determinación de NDye, las partículas deben disolverse y (3) para altas concentraciones de carga de tinte, σa(λ) no necesariamente debe estar relacionada linealmente con la cantidad de moléculas de tinte incorporadas. Una ventaja de este método es que les gustan los valores B de partículas muy pequeñas. Se pueden determinar perlas de polímero de tamaño 25 nm (Fig. 7, panel izquierdo).

Izquierda: Brillo con una unidad de L/(mol*cm) calculada como el producto del número de moléculas de tinte dentro de una partícula (NDye), el rendimiento cuántico y el coeficiente de absorción decádica molar del tinte respectivo. Derecha: Valores de brillo determinados con la unidad (1/cm2) en función de la cantidad de tinte por nm3. PSP de 1 µm (símbolos completos) y 100 nm (símbolos abiertos) y 25 nm (símbolos abiertos con punto centrado) cargado con Nile Red (círculos) e Itrybe (cuadrados). Ambos gráficos cubren 7 órdenes de magnitud.

La definición del brillo de las partículas mediante la ecuación. (19) representa claramente un enfoque más general ya que todos los parámetros son accesibles experimentalmente con espectroscopía de esfera integradora (ver Fig. 7, panel derecho). En la Fig. 7 (y SI, Fig. S8, por ejemplo) se muestra una comparación directa de los dos enfoques utilizados para la determinación de los valores B de partículas luminiscentes en unidades de (L/(mol*cm) y (1/cm2). lote de hinchamiento).

Como se puede observar en las Figs. 4, 6 y 7 y en la figura complementaria S8, aparentemente \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) no es la cantidad cuyo valor domina la amplitud de la señal medida registrada para una partícula luminiscente, pero el σa(λ). Por ejemplo, esta última cantidad es un factor de 100 a 1000 mayor para una PSP de 1 µm en comparación con una PSP de 100 nm. Las partículas de 1 µm cargadas con Itrybe tienen un \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) inferior al 1% pero muestran un valor B superior al de las PSP de 100 nm cargadas con Nile Red que exhiben una \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) de 76%. La Figura 7 indica concentraciones óptimas de carga de tinte para valores altos de B. Aparentemente, para ambos tintes, los valores de B más altos se obtuvieron para un rango de concentración de carga de tinte de 0,83 × 10–8 a 2,1 × 10–8 mol por mg de PSP.

Finalmente, para anular la influencia del tamaño físico de las partículas luminiscentes e introducir una eficiencia de luminiscencia (LE) independiente del tamaño para las partículas luminiscentes, calculamos la eficiencia de luminiscencia (LE) de dispersiones de partículas luminiscentes como el producto de la fotoluminiscencia. rendimiento cuántico \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) y la eficiencia de absorción (Qabs) de una partícula:

Los valores LE, tal como los definimos aquí, son un número sin unidades entre 0 y 1 y representan la relación entre los fotones incidentes en la sección transversal de la partícula y los fotones emitidos por la partícula (ver Fig. 8).

Eficiencia de luminiscencia LE de 1 µm (símbolos completos) y 100 nm (símbolos abiertos) PSP cargado con Nile Red (círculos) e Itrybe (cuadrados).

En términos de LE (Fig. 8), la PSP teñida con rojo Nilo de 100 nm supera claramente la PSP cargada con Itrybe de 1 µm. Además, la partícula LE escalada sobre la cantidad de tinte incorporada por 3 mg de PSP se muestra en el SI de la Fig. S9. Para aplicaciones donde se utilizan conjuntos de partículas y no partículas individuales como, por ejemplo, nanosensores sensibles a analitos, perlas portadoras para ensayos basados ​​en perlas o capas de conversión de luz o energía, la partícula LE que refleja la eficiencia del desplazamiento de fotones puede ser el parámetro más importante para la caracterización. de partículas luminiscentes y la comparación de su rendimiento.

En resumen, presentamos una escala de brillo (B) para la evaluación del rendimiento y la comparación de dispersiones de dispersión de luz de partículas luminiscentes que expresa las propiedades ópticas de las partículas relevantes para la señal en términos de cantidades espectroscópicas fundamentales. Esta escala de brillo se basa en mediciones de la sección transversal de absorción y el rendimiento cuántico de fotoluminiscencia (Φpl) con una configuración de esfera integradora única diseñada a medida para permitir la determinación absoluta de Φpl y mediciones de transmitancia y reflectancia difusa.

Este concepto de clasificación de los valores de las partículas B se mostró de manera ejemplar para dispersiones acuosas de partículas de poliestireno esféricas de tamaño cuasi monodispersas de 25 nm, 100 nm y 1 µm, teñidas homogéneamente con dos tintes en concentraciones variables. Estos fluoróforos fueron elegidos para diferir en su comportamiento solvatocrómico y superposición espectral entre sus bandas de absorción y emisión y, por tanto, en su reabsorción. Posteriormente, Φpl de estos materiales y las propiedades ópticas, es decir, los coeficientes de absorción y dispersión µa y µs, se determinaron a partir de soluciones de la teoría del transporte de radiación basadas en mediciones de reflexión y transmisión de las dispersiones de partículas con nuestra configuración de esfera integradora. Este procedimiento fue validado con materiales sin teñir. Para nuestros compuestos modelo, calculamos además σa (λ), n2 y Qabs (λ) dependiendo del número de moléculas de tinte incorporadas teniendo en cuenta la teoría de Mie. Finalmente, definimos una eficiencia de luminiscencia (LE) sin unidades como el producto de la eficiencia de absorción y Φpl que representa efectivamente la fracción de fotones absorbidos y reemitidos de una partícula y determinamos estos valores para partículas teñidas de tinte.

En general, el procedimiento descrito permite la determinación de las propiedades de dispersión y absorción de medios que contienen partículas de dispersión de luz, la determinación de concentraciones numéricas y constantes de materiales, así como la identificación de las partículas con el mejor rendimiento de luminiscencia para aplicaciones técnicas y biológicas con solo una configuración de esfera integradora. El límite inferior para el tamaño de partícula es de aproximadamente 50 nm, dependiendo del índice de refracción de la partícula y del disolvente. Este concepto, que también se puede realizar con un fotómetro equipado con una esfera integradora y una configuración de esfera integradora independiente para la medición absoluta de los valores de Φpl, tiene el potencial de superar las comparaciones de intensidad relativa y puede proporcionar una escala de intensidad más general para fotoluminiscentes. partículas que dispersan la luz. En el futuro, exploraremos más a fondo la implementación de las relaciones de Kramers Kronig en el algoritmo de ajuste de Mie con respecto a un peso de parámetro optimizado.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos de Información complementaria (SI)) o están disponibles previa solicitud a los autores correspondientes.

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Este proyecto (METVES II; número de subvención 18HLT01) ha recibido financiación del programa EMPIR cofinanciado por los Estados participantes y del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea. Agradecemos las discusiones sobre los resultados del proyecto con el Dr. D. Geißler (BAM), los Dres. E. van der Pol y Rienk Nieuwland (Universidad de Ámsterdam, AMC) y la Dra. Martine Kuiper (VSL). Además, la UR agradece la financiación del consejo de investigación alemán (DFG; subvención SIREN).

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

División de Biofotónica, Instituto Federal de Investigación y Ensayo de Materiales (BAM), Richard-Willstaetter Str. 11, 12489, Berlín, Alemania

Christian Würth, Thomas Behnke y Ute Resch-Genger

Instituto Federal Físico-Técnico (PTB), Abbestr. 2-12, 10587, Berlín, Alemania

Jonas Gienger

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TB preparó las partículas teñidas de tinte y las caracterizó analíticamente. JG realizó la simulación y el análisis de datos con la teoría de Mie y las relaciones de Kramers-Kronig. CW diseñó la configuración de la esfera integradora, la construyó, realizó las mediciones espectroscópicas y el análisis de datos restante. CW y UR dirigieron las discusiones y escribieron el manuscrito. Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Christian Würth o Ute Resch-Genger.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Würth, C., Behnke, T., Gienger, J. et al. Escala de eficiencia para la dispersión de partículas luminiscentes vinculada a propiedades espectroscópicas fundamentales y mensurables. Representante científico 13, 6254 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32933-6

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Recibido: 25 de enero de 2023

Aceptado: 04 de abril de 2023

Publicado: 17 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32933-6

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