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Jan 23, 2024

Autofagia de células de Candida albicans tras la acción de la lombriz Venetin

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 14228 (2023) Citar este artículo Detalles métricos Los presentes estudios muestran el efecto del complejo proteína-polisacárido Venetina-1 obtenido del

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 14228 (2023) Citar este artículo

Detalles de métricas

Los presentes estudios muestran el efecto del complejo proteína-polisacárido Venetina-1 obtenido del líquido celómico de la lombriz Dendrobaena veneta sobre las células de Candida albicans. Son una continuación de la investigación sobre los mecanismos de acción, los objetivos celulares y los modos de muerte celular. Después de la acción de Venetin-1, se observó una tasa de supervivencia reducida de las células de levadura. Se observó que las células estaban agrandadas en comparación con los controles y deformadas. Además, se observó un aumento en el número de células con vacuolas claramente agrandadas. El proceso de autofagia detectado se confirmó mediante contraste de interferencia diferencial, microscopía de fluorescencia y microscopía electrónica de transmisión. Las vesículas autofágicas fueron mejor visibles después de la incubación de células de hongos con el complejo Venetin-1 a una concentración de 50 y 100 µg ml-1. Los cambios en las vacuolas fueron acompañados de cambios en el tamaño de las mitocondrias, lo que probablemente esté relacionado con el estrés oxidativo previamente documentado. Se caracterizaron las propiedades de agregación de Venetin-1. Con base en los resultados del potencial zeta en la interfaz Venetin-1/KCl, se determinó el punto pHiep = 4, es decir, el potencial zeta se vuelve positivo por encima de pH = 4 y negativo por debajo de este valor, lo que puede afectar las interacciones electrostáticas con otros. partículas que rodean Venetin-1.

Mucho antes de la llegada de la medicina occidental moderna y de la industria farmacéutica, el reino animal fue explotado en busca de preparados medicinales. Las lombrices de tierra eran una fuente de alimento y sustancias medicinales en las culturas antiguas. Aunque la asociación documentada de las lombrices de tierra con la medicina se remonta al año 1340 d. C., sólo en las últimas décadas se llevaron a cabo investigaciones científicas más específicas. Estos invertebrados son un componente esencial de la medicina tradicional china, en la que se utilizan preparados a base de lombrices para tratar más de 80 enfermedades, como por ejemplo asma, hipertensión, úlceras, epilepsia, enfermedades de los vasos sanguíneos o cáncer. Durante mucho tiempo, las lombrices de tierra se han utilizado ampliamente no sólo en China, Indonesia o Japón, sino también en otros países del Lejano Oriente para el tratamiento de diversas enfermedades crónicas2. En Birmania y Laos, el líquido corporal de las lombrices se utiliza para tratar la varicela3. Además, en estos países las lombrices de tierra se hornean, se pulverizan y se comen con agua de coco para acelerar la recuperación. Las decocciones de lombrices de tierra son conocidas como una fuente de vitalidad para las mujeres en posparto. En la India, las infusiones se utilizan para reducir la fiebre alta y tratar trastornos digestivos y nerviosos. En Corea, se cree ampliamente que las lombrices mejoran la salud humana y previenen muchas enfermedades4. En Vietnam, un polvo preparado a partir de lombrices de tierra es un ingrediente esencial en muchos medicamentos utilizados para tratar infecciones bacterianas y virales. En Irán, se añaden lombrices de tierra horneadas al pan para disolver los cálculos urinarios. En la isla de Java, existen cultivos especiales de lombrices de tierra destinados únicamente a fines médicos. En América del Sur, los indios Ye'Kuan utilizan lombrices de tierra para el consumo y para tratar la malaria y la leucemia5.

El cuerpo de las lombrices contiene muchos nutrientes que son esenciales para la salud humana. Los más importantes son los ácidos esteárico y palmítico, los ácidos grasos insaturados, los fosfátidos y el colesterol. Estos compuestos no sólo son necesarios sino también eficaces en el tratamiento de diversas enfermedades6. La producción de compuestos farmacológicamente importantes a partir de lombrices de tierra es un nuevo campo de la medicina moderna.

Las interacciones entre las lombrices y los microorganismos aún no se comprenden completamente. Dado que el entorno de vida de las lombrices de tierra es rico en organismos fúngicos, los hongos son la principal fuente de alimento para las lombrices de tierra7 y, al mismo tiempo, estos invertebrados tienen mecanismos que los protegen contra especies patógenas. Uno de ellos es la acción del líquido celómico (FQ), que se ha demostrado que mata las células fúngicas8. La FQ secretada por los poros dorsales contiene muchos compuestos bioactivos, por ejemplo, enzimas como proteasas9,10,11, lisozimas12,13, metaloenzimas14 y enzimas fibrinolíticas15, así como polisacáridos16, proteínas17,18,19 y nutrientes, etc. Estos factores tienen propiedades antibacterianas20. ,21, efectos antifúngicos8,22, antiinflamatorios23, antioxidantes23,24 y anticancerígenos10,11,25,26,27.

Cada año se diagnostican infecciones fúngicas invasivas en 800 millones de pacientes en todo el mundo, causando 1.660.000 muertes28,29,30, cifra superior a la tasa de mortalidad de Escherichia coli (950.000 muertes) o VIH/SIDA (864.000 muertes)31. La principal causa de infecciones fúngicas graves es Candida albicans, que representa el 70% del total de enfermedades causadas por hongos, con tasas de mortalidad de hasta el 50%30,32,33,34. La candidiasis sistémica causada por esta levadura constituye la segunda causa de muerte en bebés prematuros35. Las infecciones por C. albicans también son un problema grave en las unidades de UCI, donde es el primer patógeno más común aislado en pacientes de Europa y el cuarto en Estados Unidos36,37,38.

Candida albicans debe su éxito en la patogénesis a algunos factores. Uno de ellos es que este hongo está presente como comensal en la piel, mucosas e intestinos humanos39,40,41. La proliferación de levaduras está controlada por el sistema inmunológico, pero puede escapar a la inmunidad cuando el organismo está debilitado. Los factores de riesgo para el desarrollo de candidemia incluyen tratamiento con antibióticos, cirugías, quimioterapia, infección por VIH, edad extrema, uso de equipo médico o estancia hospitalaria prolongada39,42,43,44. En condiciones favorables, las levaduras cambian su modelo de crecimiento de unicelular a hifas o pseudohifas, forman biopelículas y se adhieren a superficies bióticas y abióticas, lo que dificulta su eliminación39,41,43,45,46. Las biopelículas también son muy resistentes a los antibióticos, lo que supone una grave amenaza para los pacientes. El tratamiento con antibióticos de la candidiasis tiene sus límites establecidos por la toxicidad de los fármacos, que no pueden administrarse a pacientes demasiado débiles. Otra limitación es la creciente resistencia de los hongos a los antibióticos. Los cambios en el material genético de C. albicans dan como resultado la aparición de bombas multifármacos o alteraciones en las vías metabólicas, lo que hace que los antibióticos sean ineficaces39,47,48.

La nanopartícula Venetina-1, una fracción (o complejo) de proteína y polisacárido con actividad antifúngica contra C. albicans, se aisló de la FQ de la lombriz de tierra Dendrobaena veneta. Sus propiedades y carácter químico fueron descritos en publicaciones anteriores49,50,51,52. Se ha demostrado que la nanopartícula tiene propiedades anticancerígenas25,53, antiagregantes54 e inmunoestimulantes55. Es importante destacar que no muestra endotoxicidad ni citotoxicidad para las células humanas normales49. Venetin-1 tiene la capacidad de inhibir el proteosoma 20S56. El objetivo de la presente investigación fue llevar a cabo una mayor caracterización de la nanopartícula y el mecanismo de su acción sobre las células del hongo C. albicans.

Los anélidos que representan la especie D. veneta se mantuvieron en condiciones controladas en el Departamento de Inmunología de la Universidad Maria Cure-Skłodowska de Lublin. Las lombrices de tierra se cultivaron en recipientes de plástico de 3 litros llenos de tierra de abono en la oscuridad a una temperatura de 20 °C y una humedad de aproximadamente 70-80%. Las lombrices fueron alimentadas dos veces por semana con verduras cocidas. La dieta se complementó con celulosa pura necesaria para hacer capullos. Se seleccionaron especímenes adultos para los experimentos (Fig. 1).

Individuos maduros de D. veneta.

Las lombrices se enjuagaron dos veces con agua destilada y se transfirieron a un recipiente de plástico lleno de lignina de celulosa húmeda durante 24 h para limpiar su tracto digestivo. A continuación, se colocó un grupo de 10 lombrices en un vaso de vidrio, se vertieron con NaCl al 0,9% y se estimularon con una corriente eléctrica de 4,5 V durante 30 s. El CF obtenido de esta manera se centrifugó durante 10 min a 2400 xg para separar los celomocitos del sobrenadante. Luego se filtró el sobrenadante a través de filtros Millipore de 0,22 µm y se incubó a 70 °C durante 10 min. Posteriormente el preparado fue dializado en bolsas de celulosa con un punto de corte de 12-14 kDa. La diálisis se realizó durante 24 h a 4 °C. Luego el fluido resultante se transfirió a tubos Eppendorf y se liofilizó. La sustancia preparada se almacenó en un congelador (-20 °C). Para fines experimentales, la concentración de proteínas se midió con el método de Bradford57.

El aislado clínico de la cepa de tipo salvaje de C. albicans, donado por el Prof. A. Kędzia del Departamento de Microbiología Oral de la Universidad Médica de Gdańsk (Polonia), y Candida krusei (Issatchenkia orientalis) ATCC 6258 (de la colección del Departamento of Inmunobiología, Universidad Maria Curie-Skłodowska en Lublin, Polonia) se utilizaron para el análisis microbiológico.

El cultivo celular de C. albicans se mantuvo en medio sólido de Sabouraud. Para el experimento, las células de levadura se cultivaron en medio líquido de Sabouraud durante 24 h a 28 °C. Se incubaron 20 µL del cultivo de células de levadura (107 UFC) en medio YPD “pobre”51 con 30 µL de sulfato de estreptomicina (Sigma) (solución acuosa con concentración de 1,4 mg mL-1) y Venetin-1 a una concentración de 25 µg. ml-1, 50 µg ml-1 y 100 µg ml-1. El volumen final de los cultivos celulares fue de 250 µL. El cultivo de control se preparó sin adición de Venetin-1. Los cultivos celulares se incubaron a 37 °C durante 48 h con agitación constante.

Las células de levadura del cultivo de control y las células después de la incubación con Venetin-1 se transfirieron a un portaobjetos microscópico en un volumen de 2 µl, se cubrieron con un cubreobjetos y se observaron con un aumento de 60 × con el uso de un microscopio óptico Olympus BX61 (Olympus , Japón) con configuración DIC. Las células se midieron utilizando el programa ImageJ (Instituto Nacional de Salud, EE. UU.). Se midieron 200 células en cada concentración.

Los cultivos de levadura se centrifugaron y el sobrenadante se suspendió en un fijador pH = 7 (tampón fosfato, glutaraldehído, sacarosa) y se incubó durante 2 h a temperatura ambiente. Luego se descartó el fijador y se añadió tampón fosfato 0,1 M. A continuación, se añadió OsO4 al 1,5% a las células sedimentadas y se centrifugaron durante 30 minutos a 2500 xg. Luego, se eliminó OsO4 y las células se resuspendieron en tampón fosfato 0,1 M y se centrifugaron durante 30 minutos a 2500 xg. Después de eso, las células se deshidrataron en soluciones de acetona en concentraciones crecientes: al 30%, 50%, 70% y dos veces al 100%. Los cultivos celulares se transfirieron a etapas SEM, se almacenaron en un desecador con gel de sílice durante 24 h y se pulverizaron con oro (recubrimiento por pulverización catódica K550X, Quorum Technologies). Se tomaron imágenes de las células con un microscopio electrónico de barrido Vega 3 (Tescan, República Checa)49.

Se centrifugaron muestras con células de C. albicans de control y células después de la incubación con Venetin-1 y se descartó el sobrenadante. El sedimento se suspendió en 200 µl de una solución de GH, se centrifugó (10 min, 6000 xg) y se retiró casi todo el sobrenadante. Las células fúngicas en la solución de GH se colocaron en una cámara de sublimación durante 12 minutos a –92 °C. Luego, las muestras se cortaron con una cuchilla especial en la cámara de preparación y se observaron con el uso de un microscopio SEM EM ZEISS Ultra Plus (Carl Zeiss, Alemania) a 5 kV.

Se prepararon células de Candida albicans para teñir con fluorocromos como se describió anteriormente en "Microorganismos". Luego se incubaron suspensiones celulares con diferentes fluorocromos en condiciones adecuadas para visualizar los orgánulos celulares. Las células de levadura teñidas se observaron utilizando un microscopio confocal (Carl Zeiss, Alemania) con inmersión.

El diclorhidrato de quinacrina (Sigma-Aldrich) tiñe orgánulos ácidos como cuerpos autofágicos (fluorescencia amarillenta) y autofagosomas (fluorescencia azul). Las células fúngicas para la tinción con diclorhidrato de quinacrina se mezclaron en una proporción de 10 µL de la suspensión celular con 10 µL de fluorocromo (1 mg mL-1 de solución acuosa) y se incubaron durante 10 minutos a 37 °C en la oscuridad. Se transfirieron 2 µl de suspensión celular a un portaobjetos de vidrio, se cubrieron con un cubreobjetos y se observaron a una longitud de onda de excitación de 436 nm para quinacrina.

La prueba LIVE/DEAD se utiliza para distinguir entre células metabólicamente activas, inactivas y muertas. Sin embargo, también se tiñen orgánulos celulares como las mitocondrias. Para el experimento, las células de C. krusei se prepararon de la misma forma que las células de C. albicans. Las suspensiones de células de levadura se centrifugaron, se eliminó el sobrenadante y los sedimentos se suspendieron en tampón GH. A continuación, los cultivos de células de levadura se mezclaron con FUN-1 al 10% en tampón GH en una proporción de 1:1 y se incubaron durante 30 minutos a 30 °C. Se transfirieron 2 µl de células teñidas a portaobjetos microscópicos y se observó fluorescencia a una longitud de onda de emisión de 480 nm49. Las células con inserciones rojas en el citoplasma se consideraron activas y las células verdes y amarillas, inactivas. Las mitocondrias tenían una fluorescencia de color amarillo verdoso en la periferia de las células.

El naranja de acridina (AO) es un fluorocromo que indica afinidad por los ácidos nucleicos y los compartimentos celulares ácidos. Se mezcló una solución acuosa de AO (0,1 mg ml-1) con la suspensión de células de levadura en una proporción de 1:1 y se incubó durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Se colocaron muestras en un volumen de 2 µL sobre un cubreobjetos y se observaron a la longitud de onda de excitación λ = 502 nm y a la longitud de onda de emisión λ = 526 nm usando un microscopio Zeiss/LEO 912AB con un aumento de 1000 ×51. Las células sometidas al proceso de autofagia se contaron después de la tinción con naranja de acridina con el programa ImageJ utilizando la multiherramienta. Se contaron aproximadamente 500 células en cada muestra y el experimento se repitió tres veces.

Los cultivos de células de levadura (preparación descrita en "Microorganismos") se fijaron en GA (glutaraldehído al 4% en tampón cacodilato 0,1 M, pH = 7,2). A continuación, los cultivos de C. albicans se centrifugaron (2500 xg, 12 min) y se enjuagaron dos veces con tampón cacodilato 0,1 M con centrifugación (2500 xg, 12 min). Luego, el sedimento se fijó en KMnO4 al 1,5% durante 1 h 15 min a 5 °C. Pasado este tiempo, las células se enjuagaron varias veces con agua destilada hasta que descoloraron. Luego, las células fúngicas incluidas se contrastaron con acetato de uranio al 1%, se deshidrataron con concentraciones posteriores de etanol, se filtraron y se incluyeron en resina (LR White). Luego, los bloques de resina se cortaron en secciones ultrafinas y se observaron utilizando un microscopio electrónico de transmisión JEM-1400Flash (JEOL, Japón).

El análisis de citometría de flujo de células de levadura vivas/muertas se realizó utilizando una mezcla de yoduro de propidio (10 µg ml-1 de solución acuosa) y Hoechst 33342 (5 µg ml-1 de solución acuosa) mezclados en una proporción de 2:1. Los cultivos celulares se incubaron con una mezcla de tinción a temperatura ambiente durante 20 minutos en la oscuridad; luego se añadió agua destilada hasta un volumen final de 800 µL58. El análisis se realizó utilizando un citómetro de flujo Guava easyCyte (Luminex, EE. UU.) con un láser de 695/50 nm (Red-B-HLog), un láser de 785/70 nm (NIR-R-HLog), Forward Scatter (FSC-HLog ), Dispersión lateral (SSC-HLog), Umbral establecido en FSC en 68 y el número total de células contadas 5000. Los diagramas de puntos obtenidos se controlaron con el marcador Quad Stat para viables (cuadrado superior izquierdo) y muertos (cuadrado inferior izquierdo). cuadrado) regiones celulares.

Venetin-1 a una concentración de 1 mg mL-1 se sometió a ultrasonidos durante 10 minutos a 40 °C en una cámara ultrasónica (Pol-Sonic, Polonia). Luego, la muestra se vitrificó en una solución acuosa sobre la rejilla TEM cubierta con una película de carbono Quantifoil R 2/2 (Quantifoil Micro Tools GmbH, Großlöbichau, Alemania). Antes de las observaciones, las rejillas se activaron con plasma de oxígeno durante 15 s en un limpiador de plasma Femto (Diener Electronic, Alemania). A continuación, se transfirieron 3 μl de la suspensión de Venetin-1 a la rejilla, se secaron con papel de filtro y se sumergieron en etano líquido para su congelación instantánea con Vitrobot Mark IV (FEI Company, EE. UU.). Antes de las observaciones, las muestras se almacenaron en nitrógeno líquido. Para transferir las muestras al microscopio TEM, se cargaron en el soporte Gatan 626 Cryo-TEM (Gatan Inc., EE. UU.)59. Las muestras se observaron utilizando un microscopio Tecnai F20 X TWIN (FEI Company, EE. UU.) con un voltaje de aceleración de 200 kV del cañón de emisión. Para grabar las imágenes se utilizó una cámara Eagle 4k HS (FEI Company, EE. UU.).

Se utilizó la técnica DLS con Prometheus Panta para caracterizar la nanopartícula Venetin-1. Proporciona datos de la más alta calidad sobre las características biofísicas del material analizado. Venetin-1 se disolvió en agua a una concentración de 1,3 mg mL-1. Las muestras se cargaron en ocho capilares que actuaban como réplicas, donde un análisis paralelo nos permitió analizar la homogeneidad de las nanopartículas y su capacidad de agregación en diferentes condiciones de temperatura.

Las mediciones de movilidad electroforética, conductividad y potencial zeta de la solución de NaCl con una concentración de KCl 10–4, 10–3 M y 10–3 M se llevaron a cabo utilizando el Zetasizer Nano ZS90 de Malvern. Se aplicó la ecuación de Smoluchowsky debido al valor de κa ~ 150. Las mediciones se realizaron a una concentración sólida de Venetin-1 de 100 ppm. El compuesto se añadió a la solución y se sometió a dispersión utilizando la sonda de ultrasonido Sonicator XL 2020 producida por Misonix. Luego, la suspensión se vertió en matraces de 125 ml y se estableció el pH en el rango de 3 a 11 utilizando soluciones de HCl y NaOH 0,1 M. Para cada solución se realizaron cinco mediciones de movilidad electroforética, conductividad y potencial zeta.

Todas las mediciones se realizaron utilizando un lector de microplacas Fluostar Omega (BMG Labtech, Alemania) y placas negras o transparentes de 96 pocillos (BRAND, Alemania). La tripsina bovina recombinante se adquirió de Sigma-Aldrich (Alemania) y la quimotripsina fue proporcionada por Bachem (Alemania). El dominio catalítico matriptasa-1/ST14 humano recombinante se adquirió de R&D Systems (EE. UU.). La matriptasa-2 humana recombinante se obtuvo de Enzo Life Sciences (Suiza). La furina recombinante humana soluble fue amablemente donada por la Dra. Anna Kwiatkowska60 del grupo del Prof. Robert Day (Université de Sherbrooke, Canadá).

Se utilizaron los siguientes tampones de ensayo: Tris-Cl 50 mM, pH 8,3 con CaCl2 20 mM (tripsina y quimotripsina), Tris-HCl 50 mM, pH 8,3 con NaCl 150 mM y Triton X 100 al 0,01% (matriptasa-1 y matriptasa- 2), y HEPES 100 mM pH 7,5 con CaCl2 1 mM y 1,8 mg mL-1 de albúmina sérica bovina (furina). En los ensayos se utilizaron los siguientes sustratos cromogénicos o fluorogénicos: clorhidrato de 4-nitroanilida de Nα-benzoil-d,l-arginina (BAPNA, Bachem, Alemania) en una concentración final de 4,60 mM para tripsina, Suc-Ala-Ala-Pro- Leu-pNA (Bachem, Alemania) en una concentración final de 1,69 mM para α-quimotripsina, Boc-Gln-Ala-Arg-AMC (Pepta Nova, Alemania) en una concentración final de 5 µM para matriptasa-1 (MT1) y matriptasa-2 (MT2) y Pyr-Arg-Thr-Arg-AMC (Pepta Nova, Alemania) en una concentración final de 20 µM para furina. Las concentraciones de las enzimas fueron las siguientes: 138 nM de tripsina, 141 nM de quimotripsina, 1,25 ng mL de MT1, 1,51 U mL de MT2 y 1,1 nM de furina.

La concentración de la solución madre de tripsina bovina se determinó espectrofotométricamente a 410 nm mediante titulación con el sustrato cromogénico de explosión 4-nitrofenilo 4-guanidinobenzoato (NPGB, Sigma-Aldrich, EE. UU.). Posteriormente, se utilizó la solución de tripsina estandarizada para titular el tercer dominio ovomucoide de pavo (OMTKY-3 (Sigma-Aldrich, EE. UU.) utilizado como inhibidor mutuo de tripsina y quimotripsina) con BAPNA como sustrato. Luego, se usó OMTKY-3 para determinar la concentración de la solución madre de α-quimotripsina en presencia de su sustrato Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA. En el caso de MT1 y MT2 las concentraciones se calcularon de acuerdo con la información proporcionada por los proveedores.

El compuesto probado se añadió a la proteasa apropiada en diferentes concentraciones y se incubó en tampón de ensayo a 37 °C durante 30 min. Pasado este tiempo, se añadió la solución de un sustrato adecuado. Las reacciones se monitorearon durante al menos 35 min a 37 °C. El volumen final en cada pocillo fue de 200 µL. Las mediciones se llevaron a cabo utilizando longitudes de onda de excitación y emisión de 380 nm y 450 nm (para los sustratos de MT1, MT2 y furina), y la absorbancia de los sustratos de tripsina y quimotripsina se controló a 410 nm. Se calculó el porcentaje de inhibición de una enzima en relación con la muestra de control sin el inhibidor. La determinación de las actividades inhibidoras se realizó según Gitlin et al.61 y Gitlin-Domagalska et al.62.

Los valores de CI50 (concentraciones de inhibidor que dan un 50% de inhibición de la actividad enzimática) se calcularon a partir de gráficos de actividad enzimática (% de la muestra de control) versus la concentración de inhibidor utilizando un modelo de ajuste de cuatro parámetros (GraFit 5.0.12 Erithacus Software Ltd.). Los valores de CI50 se determinaron a partir de mediciones por triplicado con al menos diez concentraciones diferentes de inhibidor.

Los análisis estadísticos para evaluar los cambios en el número de células de C. albicans con cuerpos autofágicos y los cambios en el tamaño celular después del tratamiento con Venetin-1 se realizaron con el programa Statistica (Tibco Software Inc., EE. UU.; número de serie: JPZ009K288211FAACD-Q ). Se utilizó la prueba de Shapiro-Wilk para verificar el tipo de distribución de los datos y la prueba de Levene para determinar la homogeneidad de la varianza. Se utilizaron la prueba post-hoc Tukey HSD y el ANOVA unidireccional para examinar el nivel de significancia de las diferencias en el número de células con cuerpos autofágicos y los cambios en el tamaño celular.

El análisis de citometría de flujo de células de C. albicans tratadas con Venetin-1 realizado con una mezcla de Hoechst 33342 y yoduro de propidio mostró cambios significativos en el nivel de células muertas en los cultivos tratados con Venetin-1 en comparación con el cultivo de control (Fig. 2). ). El lado superior izquierdo del diagrama de puntos muestra que el 86% de las células eran viables en el cultivo de control. Después de la incubación con Venetin-1, el nivel disminuyó a 62,34 %, 56,34 % y 30,02 % en los cultivos después del tratamiento con el compuesto activo a 25 µg ml-1, 50 µg ml-1 y 100 µg ml-1, respectivamente.

Análisis de citometría de flujo de células viables y muertas utilizando una mezcla de fluorocromos de Hoechst 33342 y yoduro de propidio. El cuarto superior izquierdo bloquea las células viables; el cuarto inferior izquierdo contiene células muertas.

Se tomaron imágenes mediante SEM de las células de C. albicans de control y de las tratadas con Venetin-1. El análisis de morfología mostró que las células del cultivo de control tenían una forma ovalada y una pared celular rugosa pero regular (Fig. 3A1-A2). Después de la incubación con Venetin-1 a una concentración de proteína de 50 µg mL-1, las células de levadura experimentaron cambios visibles. Las células expuestas al compuesto activo aumentaron claramente de tamaño en comparación con las células de control (Fig. 3B1-B2). Además, la Fig. 3B1 muestra una célula con la capa exterior de la pared celular exfoliada, y la deformación de la forma de la célula es visible en la Fig. 3B2. Después del tratamiento con Venetin-1 a 100 µg mL-1 (Fig. 3C1-C2), se observaron células agrandadas (Fig. 3C1-C2), así como células con numerosas cicatrices de división y formas encogidas (Fig. 3C2). El tamaño celular promedio fue de 5,67 µm en el cultivo celular de control, 7,28 µm en el cultivo tratado con Venetin-1 a la concentración de 25 µg mL-1, 7,1 µm en la variante con la concentración de 50 µg mL-1 y 7,37 µm en el cultivo celular de control. µm en el tratamiento con la concentración de 100 µg mL-1 (Tabla de información complementaria S1, Fig. S1). La distribución de datos paramétricos se determinó con la prueba de Shapiro-Wilk (resultados en la Tabla complementaria S1). Los resultados de la prueba de Levene (F(3, 795) = 12,3181; p <0,001) indicaron varianzas no homogéneas. La significación estadística se analizó con la prueba post-hoc Tukey HSD y ANOVA unidireccional: F(3, 795) = 219,12; p<0,001.

Imágenes SEM de células de C. albicans. (A1,A2) Células de C. albicans del cultivo de control, (B1,B2) Células de C. albicans después de la incubación con Venetin-1 a 50 µg ml-1, (C1,C2) a 100 µg ml-1. Las imágenes (B1-C2) muestran células agrandadas y deformadas. La barra de escala representa 2 µm.

Las células del cultivo de control de C. albicans y las células tratadas con Venetin-1 fueron obtenidas mediante DIC. Las células del cultivo de control tenían una forma ovalada con una vacuola que constituía no más de la mitad de la luz celular (Fig. 4A). Después de la exposición a la preparación a una concentración de 50 µg mL-1, se observaron células agrandadas con vacuolas claramente agrandadas que ocupaban la mayor parte de la luz celular (Fig. 4B). Se notaron pequeñas vesículas (autofagosomas) (marcadas con flechas rojas en la Fig. 4B) en el borde exterior de la vacuola. Después de la incubación de las células de levadura con Venetin-1 a una concentración de 100 µg mL-1, además de vacuolas y autofagosomas agrandados (marcados con flechas rojas), había vesículas que penetraban la vacuola o ya estaban presentes en su interior (marcadas con flechas verdes). en la Fig. 4C,D; cuerpos autofágicos). Después de la exposición a la preparación a una concentración más alta (100 µg mL-1), definitivamente hubo más vesículas alrededor de la vacuola que en el tratamiento con el complejo a una concentración de 50 µg mL-1. Cuando fueron absorbidas por las vacuolas, perdieron su forma redonda habitual.

Imágenes DIC y Cryo-SEM de células de C. albicans: (A – D) Imágenes DIC: (A) células de cultivo de control, (B) células después de la incubación con Venetin-1 a una concentración de 50 µg mL-1, (C, D) a la concentración de 100 µg mL-1. (E,F) Imágenes crio-SEM de células después del tratamiento con Venetin-1 a 100 µg ml-1. Las flechas rojas indican autofagosomas; las flechas verdes marcan cuerpos autofágicos. La barra de escala corresponde a 2 µm.

Las imágenes E y F de la Fig. 4 muestran una sección transversal de una célula de C. albicans después del tratamiento con Venetin-1 a una concentración de 100 µg mL-1 capturada por Cryo-SEM. Las imágenes E y F presentan vacuolas y autofagosomas (marcadas con flechas). En la figura 4E se ven vacuolas grandes y en la imagen de la figura 4F se muestra un núcleo celular agrandado.

La tinción con diclorhidrato de quinacrina reveló la presencia de vesículas azules y azul verdosas ubicadas tanto dentro como fuera de las vacuolas (Fig. 5I). La tinción de estructuras celulares en las imágenes presentadas no es específica. No se observó fluorescencia de vesículas en las células del cultivo de control de C. albicans. En la imagen microscópica, solo era visible el contorno de las vacuolas de tamaño normal (Fig. 5I A1-A2). Las células de C. albicans tratadas con Venetin-1 a una concentración de 50 µg ml-1 se caracterizaron por tamaños de células y vacuolas más grandes que en el cultivo no tratado. Tanto los autofagosomas, es decir, vesículas ubicadas fuera de la luz vacuolar (indicadas por flechas rojas), como los cuerpos autofágicos, es decir, vesículas ubicadas dentro de las vacuolas (indicadas por flechas amarillas), fueron visibles (Fig. 5I B1, B2). A su vez, las células de C. albicans tratadas con Venetin-1 a una concentración de 100 µg mL-1 exhibieron una mayor cantidad de ambos tipos de vesículas autofágicas: autofagosomas (flechas rojas) y cuerpos autofágicos (flechas amarillas). El tamaño de las vacuolas no difería del tamaño normal (Fig. 5I C1-C4).

Autofagia en células de C. albicans visualizada con diferentes fluorocromos. (I) Tinción con diclorhidrato de quinacrina: A1 – A2—C. albicans controla las células de cultivo; B1–B2—C. células albicans después de la incubación con Venetin-1 a una concentración de 50 µg ml-1; C1–C4: a una concentración de 100 µg ml-1. Las flechas rojas indican autofagosomas, las flechas amarillas, cuerpos autofágicos. (II) Tinción con naranja de acridina: A1–A2—C. albicans controla las células de cultivo; B1–B2—C. células albicans después de la incubación con Venetin-1 a una concentración de 50 µg ml-1; C1–C4: a una concentración de 100 µg ml-1. Las flechas blancas indican células con vesículas autofágicas con pH ácido. La barra de escala corresponde a 1 µm.

Las observaciones anteriores fueron confirmadas por el análisis de células de C. albicans realizado con naranja de acridina (AO), que tiñe los compartimentos celulares ácidos de color naranja o rojo. Este fluorocromo se utiliza para teñir células autofágicas con vesículas fluorescentes rojas características (Fig. 5II). La imagen microscópica del cultivo de control mostró células verdes de tamaño normal (Fig. 5II A1-A2). A su vez, se observaron pequeñas manchas rojas en las células de levadura incubadas con Venetin-1 a una concentración de 50 µg ml-1, lo que indica la presencia de vesículas ácidas (señaladas con flechas blancas) (Fig. 5II B1-B2). Las células de C. albicans tratadas con Venetin-1 a una concentración de 100 µg ml-1 tenían un número significativamente mayor de vesículas rojas (indicadas por flechas blancas). Además, eran más grandes y estaban teñidas más intensamente que en las células tratadas con una concentración más baja de Venetin-1 (Fig. 5II C1-C4). El porcentaje promedio de células con cuerpos autofágicos rojos visibles fue del 9,44% en el cultivo celular control y fue mayor en las muestras tratadas con Venetin-1: 16,25% en el cultivo tratado con la concentración de 25 µg mL-1, 33,85% en el tratamiento con 50 µg mL-1, y 62,70% en la variante con 100 µg mL-1 (Tabla de información complementaria S2, Fig. S2). La distribución de datos paramétricos se confirmó con la prueba de Shapiro-Wilk (resultados en la Tabla complementaria S2). Las varianzas homogéneas fueron indicadas por la prueba de Levene: F (3, 8) = 1,1395; p = 0,313115. La significación estadística se analizó con la prueba post-hoc Tukey HSD y ANOVA unidireccional: F(3, 8) = 423,51; p = 0,000.

La ultraestructura de las células de C. albicans después de la aplicación de Venetin-1 se analizó mediante microscopía electrónica de transmisión. Las células de control se caracterizaron por una pared celular regular y una estructura intracelular normal con orgánulos visibles, es decir, el núcleo (N), una única vacuola (V) y mitocondrias (M) sin signos de autofagia (Fig. 6A). A su vez, se observaron numerosas vesículas autofágicas de dos tipos en las células de C. albicans incubadas con Venetin-1 en concentraciones de 50 µg ml-1 y 100 µg ml-1. Además, las células tratadas con el complejo tenían vacuolas más grandes y más mitocondrias que las células del cultivo de control.

Imágenes TEM de células de C. albicans: (A) célula de control; (B1, B2) células después de la incubación con Venetin-1 a una concentración de 50 µg mL-1; (C1,C6) a la concentración de 100 µg mL-1. Vacuola V, núcleo N, mitocondria M, flechas rojas: autofagosomas; flechas amarillas: cuerpos autofágicos. La barra de escala corresponde a 1 µm.

La técnica TEM permitió observar varios pasos del proceso de autofagia. En el citoplasma celular se observaron autofagosomas maduros y completamente cerrados (indicados por flechas rojas) que transportaban su contenido a la vacuola (Fig. 6B1-B2, C1-C6). Posteriormente, se capturaron las etapas de fusión del autofagosoma con vacuolas, liberación de la vesícula interna en la luz de la vacuola y formación de cuerpos autofágicos (Fig. 6B1, C3, C6; los cuerpos autofágicos están señalados con flechas amarillas).

Las vesículas visibles en el citoplasma variaron de tamaño, lo que puede indicar la aparición de diferentes tipos de macroautofagia. Los autofagosomas más grandes son típicos de la macroautofagia no selectiva, donde la vesícula contiene citoplasma en masa, y los más pequeños son típicos del proceso selectivo, donde estructuras específicas de la célula de levadura constituyen el contenido. Sin embargo, en las células de C. albicans tratadas con Venetin-1 a una concentración de 50 µg ml-1, todas las vesículas de autofagia eran notablemente más grandes que en las células incubadas con Venetin-1 a una concentración de 100 µg ml-1. Las imágenes presentadas son representativas de las 30 imágenes obtenidas.

El kit de viabilidad de levaduras vivas/muertas se utiliza como estándar para determinar la actividad metabólica de las células fúngicas. El análisis se basa en la capacidad de las células para metabolizar el colorante FUN-1, como resultado de lo cual se ven estructuras rojas en las vacuolas celulares. Ha sido utilizado en nuestros estudios previos49. El uso de este kit facilitó la visualización adicional de las mitocondrias (Fig. 7). El etiquetado de estos orgánulos fue un efecto no específico. El cultivo de control de C. albicans se caracterizó por células metabólicamente activas con estructuras rojas dentro de la vacuola. A su vez, no se observaron otras estructuras aparte de las vacuolas en las células de control (Fig. 7A1-A2). Después de la incubación de las células de C. albicans con Venetin-1 en concentraciones de proteína de 25, 50, 100 µg ml-1, se observó una fluorescencia amarilla puntual de numerosas mitocondrias. Estos orgánulos estaban dispuestos de una manera característica formando un anillo debajo de la superficie de la membrana (Fig. 7B1 – B2, C1 – C2, D1 – D2; señalados por flechas).

Visualización de mitocondrias en células de C. albicans y C. krusei después de teñir con FUN-1: (A1,A2,E1,E2) células de cultivo de control; (B1,B2,F1,F2) células después de la incubación con Venetin-1 a una concentración de 25 µg mL-1; (C1,C2,G1,G2) a la concentración de 50 µg mL-1; (D1,D2,H1,H2) a la concentración de 100 µg mL-1. Las flechas indican células con mitocondrias teñidas. La barra de escala corresponde a 3 µm.

Para confirmar nuestras observaciones de las mitocondrias, también se incubó con Venetin-1 otra cepa de Candida, C. krusei. El efecto de la fluorescencia mitocondrial después del tratamiento con Venetin-1 en este caso fue más fuerte. Las células de control no mostraron mitocondrias teñidas (Fig. 7E1-E2). A su vez, en las células incubadas con el compuesto activo eran claramente visibles mitocondrias fluorescentes de color amarillo verdoso. Después del tratamiento de células de C. krusei con Venetin-1 a una concentración de 25 µg mL-1, sus mitocondrias eran pequeñas y visibles como manchas dispuestas en la periferia de las células (Fig. 7F1-F2; señaladas por flechas). En el caso de las células tratadas con Venetin-1 en concentraciones de 50 y 100 µg ml-1, se observaron formas alargadas de mitocondrias brillantemente fluorescentes (Fig. 7G1 – G2, H1 – H2; señaladas por flechas).

El análisis del complejo Venetin-1 mediante Cryo-TEM confirmó el tamaño de las nanopartículas determinado por el análisis DLS25. Las nanopartículas eran visibles bajo el microscopio como formas esféricas, que a veces se fusionaban para formar formas dobles indicadas por flechas rojas en las figuras 8A, B.

Visualización crio-TEM de Venetin-1. Las nanopartículas son visibles como estructuras circulares oscuras que a veces se fusionan en una forma doble (indicada por flechas rojas).

Tras el análisis del tamaño de Venetin-1 (58,23 ± 3,93 nm)25 realizado con el uso de Prometheus Panta, se realizó un experimento de fusión por temperatura con un gradiente de temperatura de 25 a 95 °C y una rampa de calentamiento de 1 °C/min. Como se muestra en la Fig. 9, las nanopartículas muestran una transición única de 350/330 nm a una temperatura de 64,95 °C ± 0,08 °C. Es muy probable que esta transición correspondiera al punto de fusión de las nanopartículas analizadas. Además, se determinó que, luego del cambio conformacional representado por la relación de fluorescencia 350/330 nm, las nanopartículas analizadas experimentaron agregación con el Tagg 66,92 ± 0,16 °C y inicio de agregación 58,97 ± 1,15 °C. Curiosamente, el análisis DLS sobre la marcha mostró claramente un aumento en el tamaño general de las nanopartículas, lo que resultó en la formación de nanopartículas más grandes de 100 nm a una temperatura por encima del punto de fusión (Fig. 9, Tabla 1).

Perfil de fusión de Prometheus Panta de nanopartículas de Venetin-1. Desde arriba: Panel 1: relación 350/330 nm correspondiente a los cambios conformacionales en las nanopartículas. Panel 2: Primera derivada de la relación 350/330 nm; Panel 3: turbidez que muestra la agregación; Panel 4: análisis de distribución de tamaños.

Se realizaron cinco mediciones de movilidad electroforética, conductividad y potencial zeta para cada solución (Tabla 2) (Fig. 10A, B). El potencial zeta de las muestras analizadas, en el pH analizado, oscila entre 3 y 12 y las diferentes concentraciones de electrolitos oscilan entre 10 y -40 mV. En la mayoría de los rangos probados, los sistemas seleccionados son inestables en forma coloidal y pueden estar deslaminados. Se obtuvieron sistemas estables a un potencial absoluto inferior a − 30 mV solo para las siguientes muestras: V-1/NaCl 0,0001 M a pH = 7, 9, 11; V-1/KCl 0,001 M a pH <8 (Fig. 10B). La comparación de los resultados para NaCl 0,001 mol/dm3 y KCl 0,001 M mostró valores absolutos muy diferentes para pH > 4 en las mismas concentraciones de electrolitos (Fig. 10A, B). Por lo tanto, se descubrió que el potencial de superficie de Venetin-1 ejerce el principal impacto sobre el potencial zeta.

(A) Dependencia del potencial ζ de Venetin-1 en la función de pH en soluciones de NaCl 0,001 M y 0,0001 M. (B) Dependencia del potencial ζ de Venetin-1 en la función de pH en soluciones de NaCl 0,001 M y KCl 0,001 M.

Como se muestra en la Fig. 10A, B, el sistema estudiado tenía los valores absolutos más altos del potencial zeta en la concentración de electrolito más baja y los valores absolutos más bajos en la concentración de electrolito más alta. Se encontró que el potencial zeta disminuía con el aumento de la concentración de electrolito, como resultado de la disociación de las superficies sometidas a ionización en Venetin-1. En los sistemas examinados, el potencial zeta disminuyó al aumentar el pH. El estado de la superficie sólida en el que las cantidades de cargas positivas y negativas en la capa difusa de la doble capa eléctrica (edl) son iguales entre sí se denomina punto isoeléctrico de la superficie sólida (IEP—IsoElectric Point) pHIEP. Entonces, la carga resultante de la capa difusa de la doble capa eléctrica es cero. Dado que la concentración de iones formadores de potencial (H+ y OH-) depende del pH de la solución, el punto pHIEP corresponde a un valor de pH determinado con precisión. Los valores de pHIEP de Venetin-1 están por debajo de pH 6 para NaCl (Fig. 10A) y pHIEP = 4 para KCl (Fig. 10B). Esto significa que en una solución de KCl por encima de pH = 4, el potencial zeta se vuelve positivo y negativo por debajo, lo que puede afectar las interacciones electrostáticas con otras partículas que rodean a Venetin-1.

Se examinó la actividad inhibidora de Venetin-1 frente a serina proteasas seleccionadas, es decir, dos enzimas digestivas: tripsina y quimotripsina, y tres proteasas transmembrana: matriptasa-1 (MT1), matriptasa-2 (MT2) y furina. En este estudio, Venetin-1 exhibió una potencia inhibidora moderada hacia MT1 (valor IC50 de 176,608 ± 91,164 μg mL-1; Fig. 11A), mientras que la inhibición de MT2 fue mucho más notable con IC50 0,06 ± 0,01 μg mL-1 (Fig. .11B). La inhibición de la furina fue marginal a la concentración más alta de 250 μg ml-1, y esta enzima retuvo más del 70% de su actividad proteolítica inicial. Debido a la estrecha homología estructural pero a las distintas funciones fisiológicas, los inhibidores selectivos de las matriptasas son de gran interés hoy en día. Sin embargo, es esencial realizar más investigaciones más detalladas para determinar claramente la selectividad de Venetin-1 hacia MT1 y MT2, lo que está más allá del alcance de este artículo. Además, se demostró que el compuesto probado inhibía la quimotripsina (IC50 1,26 ± 0,14 µg ml-1) y era inactivo frente a la tripsina (Fig. 11C,D).

Actividad proteolítica de matriptasa-1 (A) y matriptasa-2 (B), tripsina (C) y quimotripsina (D) después del tratamiento con Venetin-1 versus la muestra de control sin el inhibidor.

Los anélidos habitan en suelos ricos en microorganismos y han desarrollado una capacidad única para sobrevivir en este entorno; por lo tanto, representan un grupo de animales que los biólogos estudian intensamente con el fin de encontrar nuevas moléculas con potenciales aplicaciones terapéuticas. Estos invertebrados modelo son cruciales para dilucidar los mecanismos de importantes procesos biológicos y de desarrollo en los organismos. Las lombrices de tierra como organismo modelo son económicas y, lo que es más importante, éticamente indiscutibles63. Actualmente, teniendo en cuenta la falta de eficacia suficiente y de acción selectiva de los preparados sintéticos, la industria farmacéutica está volviendo a sustancias bioactivas naturales que pueden resultar eficaces allí donde la medicina moderna fracasa64.

Venetin-1, previamente caracterizada como una fracción de proteína-polisacárido, también mostró actividad inhibidora contra C. albicans ATCC 10231 y C. krusei ATCC 6258. Venetin-1 interrumpió la división celular y provocó la muerte de las células fúngicas49. La preparación indujo cambios en la estructura de la pared celular del hongo y en las propiedades nanomecánicas de la pared celular, como lo demuestra la microscopía de fuerza atómica (AFM)50. Tras la incubación de C. albicans con Venetin-1, el ADN mitocondrial migró hacia el ADN nuclear. Ambos materiales genéticos se combinaron en una estructura nuclear, que fue el comienzo del proceso de apoptosis. Se observó que el compuesto analizado afectó la expresión de proteínas del estrés oxidativo51. Se demostró que la parte proteica de la nanopartícula consiste principalmente en dos proteínas lisenina50. También se confirmó la presencia de compuestos de carbohidratos en la preparación. El compuesto analizado no mostró endotoxicidad ni citotoxicidad en relación con los fibroblastos de piel humana normal49.

En análisis anteriores, se demostró que Venetin-1 causa la muerte celular de C. albicans mediante necrosis y apoptosis49,51. Generalmente, existen tres tipos principales de muerte celular: apoptosis, necrosis y autofagia. La apoptosis, o muerte celular programada, es un proceso activo que requiere la activación de muchos genes y gasto energético. La necrosis, a diferencia de la apoptosis, es un proceso pasivo y patológico. Este tipo de muerte se produce bajo la influencia de factores físicos, químicos y biológicos tras superar el valor umbral de inmunidad celular. La autofagia es un mecanismo denominado muerte celular programada tipo II65. En este proceso, proteínas de vida media larga y otros componentes de orgánulos son dirigidos a las vacuolas, donde se degradan66,67. En el presente estudio, se observó autofagia durante el análisis de la acción de Venetin-1.

La autofagia, que es un proceso específico de las células eucariotas, tiene tres formas principales: autofagia mediada por chaperonas, microautofagia y macroautofagia. La macroautofagia es el tipo más común y se activa para degradar orgánulos y proteínas dañados. Una pequeña cantidad de citoplasma que contiene estructuras dañadas es envuelta por una vesícula de doble capa que crea un autofagosoma y se transporta a la vacuola. La capa externa del autofagosoma se fusiona con la membrana vacuolar, y la capa interna con su contenido pasa al interior de la vacuola como un cuerpo autofagosómico, donde es degradado por las enzimas vacuolares68,69,70.

Los análisis de vacuolas presentados mediante microscopía fluorescente y microscopía electrónica de transmisión mostraron de manera convincente el proceso de autofagia, es decir, la absorción de vesículas después de la incubación con Venetin-1. Las células de C. albicans tratadas con Venetin-1 tenían vacuolas significativamente más grandes que las células de control. Esos cambios pueden tener una fuente en el proceso de autofagia, donde cada autofagosoma agrega su membrana a la membrana vacuolar. Esta entrada adicional de la membrana no se equilibra con la salida y conduce al agrandamiento de las vacuolas y a la dilución del contenido intramembrana71,72,73,74.

El proceso de autofagia suele implicar conducir a la célula a través de condiciones de vida desfavorables. La autofagia puede ser una estrategia para la supervivencia celular en condiciones de estrés como el hambre, la hipoxia o el uso de quimioterapia. El mecanismo de autofagia se activa para obtener una fuente adicional de energía.

La autofagia es un proceso esencial para la supervivencia celular, ya que elimina orgánulos y moléculas dañados o anormales que pueden alterar la homeostasis celular. Tras la acción de Venetin-1, se observó estrés oxidativo, que provocó daños en las estructuras intracelulares. Hay estudios que demuestran que las ROS (especies reactivas de oxígeno) desempeñan un papel regulador en el proceso de autofagia; la aparición de ROS activa este proceso. La activación del proceso de autofagia por ROS tiene como objetivo minimizar el daño inducido por ROS75.

Las ROS mitocondriales pueden ser beneficiosas o perjudiciales para las células dependiendo de su concentración y ubicación76. La mitofagia, donde se degradan las mitocondrias ineficientes, es un tipo de autofagia selectiva. Las mitocondrias proporcionan la mayor parte de la energía que necesita la célula. La producción de energía por parte de las mitocondrias va acompañada de la generación de ROS. Una mayor cantidad de ROS mitocondrial daña los componentes celulares, incluidas las mitocondrias. Esto conduce a diversos cambios patológicos y provoca la muerte celular76. Un proceso importante para la célula es la eliminación de mitocondrias hiperactivas o dañadas para mantener la homeostasis mitocondrial. Esta eliminación debe realizarse de manera oportuna para no causar más daño celular77,78.

Después del tratamiento de las células de C. albicans con Venetin-1, estas mitocondrias hiperactivas aumentaron de tamaño y mostraron una fluorescencia más fuerte en la imagen microscópica. Además, a este respecto se analizó la cepa de C. krusei. Resultó que el efecto se repitió y fue aún más fuerte que en el caso de C. albicans, y las mitocondrias eran visibles como estructuras grandes y alargadas ubicadas en el borde de la célula. En nuestros estudios anteriores se observaron mitocondrias agrandadas y una mayor producción de ROS51,52. Hay datos que informan que las proteínas de la membrana externa mitocondrial han sido identificadas como receptores de mitofagia en la levadura77. El parche de vacuolas y mitocondrias es un tema interesante y cada vez más discutido en la caracterización de la biología de las levaduras. En las células de C. albicans, la vacuola Mcp1 y la proteína del parche mitocondrial (vCLAMP) participan en el mantenimiento de la función mitocondrial y la mitofagia77. Los cambios morfológicos y proteómicos observados en las células de C. albicans después del tratamiento con Venetin-151 sugieren la aparición de mitofagia, que se analizará en futuras investigaciones.

En una publicación anterior51 se presentaron micrografías SEM de células de C. albicans después del tratamiento con la preparación de prueba. En esos estudios, mostramos deformaciones celulares y cambios en la superficie de la pared celular, que era irregular después de la acción del compuesto analizado. En los estudios actuales, hemos demostrado un agrandamiento celular significativo después de la incubación con Venetin-1 en comparación con las células del cultivo de control, lo que está relacionado con la autofagia.

Después de la acción de Venetin-1, se observaron numerosas cicatrices posteriores a la división en la superficie de las células. Fueron similares a los observados en micrografías SEM después de la exposición al fluconazol, un fármaco conocido que altera la estructura de la membrana celular de C. albicans79. En nuestra opinión, la célula que se divide muchas veces en poco tiempo no logra producir los compuestos constructores necesarios para sintetizar las estructuras de la pared celular en lugar de las cicatrices. Además, se producen alteraciones en el interior de la célula, cuya inhibición está asociada al gasto de energía celular para mantener viva la célula.

Continuando con la caracterización multidireccional de la nanopartícula Venetin-1, decidimos analizar el potencial zeta de este complejo. Una cantidad importante de partículas dispersas en el líquido es su estabilidad, es decir, la capacidad de las partículas de permanecer en forma de dispersión coloidal. Las dispersiones que son inestables pueden sufrir procesos de coagulación o sedimentación, que resultan en la deslaminación de la muestra. El potencial zeta es el potencial que se produce en la doble capa en la superficie de las partículas dispersas. Es un potencial entre el dispersante y la capa de fluido adherida a la superficie de la partícula. Este parámetro se utiliza para determinar la estabilidad de los sistemas coloidales. Se supone que la dispersión es estable para un valor absoluto de potenciales zeta >|± 30| V. Estas condiciones fueron cumplidas por algunas de las muestras analizadas. El potencial zeta de Venetin-1 depende del potencial de superficie. El potencial zeta se midió en el rango de pH de 3 a 7 en el electrolito de NaCl 0,001 M y en el rango de pH de 3 a 8 en KCl 0,001 M. Los sistemas probados eran inestables y agregados, lo que se confirmó mediante las mediciones del tamaño de partículas realizadas mediante el método de dispersión dinámica de luz.

El presente estudio demostró que Venetin-1 además exhibe actividad inhibidora hacia ciertas enzimas proteolíticas, a saber, matriptasa-1 (MT1), matriptasa-2 (MT2) y quimotripsina. Ambas matriptasas son serina proteasas transmembrana de tipo II, tienen especificidad similar a la tripsina y comparten una alta similitud estructural, pero difieren en su actividad biológica80. MT1 afecta la formación e integridad de los tejidos epiteliales y está implicado en varios cánceres derivados de epitelios, incluidos tumores de mama, próstata y ovario81. Cabe destacar que su mayor actividad a menudo se considera un factor predictivo de mal pronóstico del cáncer82. MT2 actúa como regulador proteolítico en la homeostasis del hierro humano. Las mutaciones en su gen, TMPRSS6, se correlacionan con la anemia ferropénica refractaria al hierro, mientras que su actividad regulada al alza puede provocar trastornos por sobrecarga de hierro83. La actividad inhibidora de Venetin-1 contra furina, es decir, una serina proteasa transmembrana de tipo I implicada en la escisión de muchos precursores de proteínas inactivas en la vía secretora constitutiva, fue insignificante84.

Además, los análisis mostraron que Venetin-1 inhibía fuertemente la quimotripsina y era inactiva frente a la tripsina. Ambas enzimas proteolíticas son serina proteasas pancreáticas implicadas en la digestión de alimentos que muestran diferentes preferencias de sustrato. La tripsina hidroliza específicamente los enlaces peptídicos después de los residuos de aminoácidos básicos, como Lys y Arg, mientras que la quimotripsina escinde los enlaces peptídicos formados por los grupos carboxilo de los residuos aromáticos Tyr, Phe y Trp o de los residuos alifáticos de Leu.

La inhibición de la actividad proteolítica es un mecanismo molecular muy importante mediante el cual los organismos previenen las autolesiones85 y se protegen contra patógenos86,87,88,89 o depredadores90,91,92. De todos los tipos de inhibidores de la proteasa, los inhibidores de la serina proteasa (SPI) son los más comunes93. Están muy extendidos entre los invertebrados, por ejemplo, en el camarón kuruma (Marsupenaeus japonicas), el camarón tigre negro (Penaeus monodon)92, las anémonas de mar94,95, los escorpiones93,95,96, los anquilostomas97 y numerosos animales venenosos: arañas y caracoles93,98,99. Se han descrito SPI con actividad antifúngica en el gusano de seda (Bombyx mori)100. Los estudios informados por Lee92,101 también mostraron que los SPI producidos por la ostra Crassostrea gigas tienen actividad contra el virus VIH-1. Por otro lado, se ha informado que los inhibidores de la proteasa del VIH reducen la adherencia de las células de C. albicans al inhibir las proteasas aspárticas secretadas por levaduras102,103. Se ha demostrado que la incidencia de candidiasis en pacientes infectados por el VIH se reduce significativamente104.

La industria farmacéutica ofrece varios inhibidores de proteasa, que se utilizan en el tratamiento de enfermedades humanas, como el dabigatrán utilizado en el tratamiento de la embolia pulmonar y los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (IECA) utilizados en el tratamiento de la hipertensión92,105,106. La Asociación Americana para el Estudio de Enfermedades Hepáticas (AASLD) recomienda la terapia para el virus de la hepatitis C crónica (VHC) de genotipo 1 basada en inhibidores de la serina proteasa junto con interferón α pegilado y ribavirina107. El inhibidor del proteasoma bortezomib, que también tiene actividad antifúngica108,109, ha sido aprobado para el tratamiento clínico del mieloma múltiple110. Es similar a la nanopartícula Venetin-1, que inhibe el proteosoma 20S y al mismo tiempo muestra actividad antifúngica.

El descubrimiento de inhibidores de proteasa en el entorno natural puede tener ventajas sobre el desarrollo de compuestos sintéticos con tales propiedades. Se conocen inhibidores naturales cuyo mecanismo de acción es similar al de Venetin-1, es decir, están dirigidos a orgánulos intracelulares como las mitocondrias y el núcleo y causan estrés oxidativo y muerte celular por apoptosis111,112,113. Los inhibidores de proteasas naturales superan más fácilmente los mecanismos de resistencia y son más estables y menos tóxicos. Estos argumentos apoyan la conveniencia de buscar estos compuestos en la naturaleza92.

El efecto antifúngico de la FC de lombriz de tierra se ha descrito principalmente en relación con los hongos que atacan a las plantas8,22,114. Cuando el CF se utiliza contra patógenos vegetales, la citotoxicidad del fluido es irrelevante y se puede utilizar en su forma cruda. Sin embargo, para usarse contra infecciones fúngicas en humanos, la preparación de CF debe prepararse adecuadamente para que no muestre citotoxicidad o endotoxicidad. Debido a que nuestra investigación tiene como objetivo utilizar Venetin-1 como fármaco quimioterapéutico, tuvo que pasar por muchos procesos de laboratorio para cumplir con las condiciones requeridas. Teniendo en cuenta las propiedades y los efectos antifúngicos y anticancerígenos multidireccionales de Venetin-1 y su compleja estructura, la conexión estructural de polisacáridos y liseninas parece ser un tema de investigación interesante que se explorará utilizando técnicas de diversas disciplinas científicas.

En conclusión, los análisis realizados mostraron que la disminución en la supervivencia de las células de C. albicans correspondía a cambios en la morfología de las células y de los orgánulos celulares, como las vacuolas y las mitocondrias. Se observaron cambios en las vacuolas típicos de la autofagia y agrandamiento de las mitocondrias. Se caracterizó el potencial zeta de la preparación ensayada. Se han demostrado la capacidad de agregación y las propiedades del tipo inhibidor de proteasa de la nanopartícula Venetin-1. El compuesto, que presenta actividades inhibidoras contra ciertas serina proteasas y el proteosoma 20S, parece ser un agente quimioterapéutico prometedor para combatir las infecciones por C. albicans en humanos y animales.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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La investigación presentada fue apoyada por el Proyecto del Centro Nacional de Ciencias de Polonia [2020/37/B/NZ7/00763].

Estos autores contribuyeron igualmente: Sylwia Wójcik-Mieszawska y Kinga Lewtak.

Departamento de Inmunobiología, Instituto de Ciencias Biológicas, Facultad de Biología y Biotecnología, Universidad Maria Curie-Skłodowska, Lublin, Polonia

Sylwia Wójcik-Mieszawska y Marta J. Fiołka

Departamento de Biología Celular, Instituto de Ciencias Biológicas, Facultad de Biología y Biotecnología, Universidad Maria Curie-Skłodowska, Lublin, Polonia

Kinga Lewtak

Departamento de Radioquímica y Química Ambiental, Instituto de Ciencias Químicas, Facultad de Química, Universidad Maria Curie-Skłodowska, Lublin, Polonia

Ewa Skwarek

Departamento de Bioquímica Molecular, Facultad de Química, Universidad de Gdańsk, Gdańsk, Polonia

Dawid Dębowski y Agata Gitlin-Domagalska

Centro Malopolska de Biotecnología, Universidad Jagellónica, Cracovia, Polonia

Jakub Nowak

Departamento de Anatomía Funcional y Citobiología, Instituto de Ciencias Biológicas, Universidad Maria Curie-Skłodowska, Lublin, Polonia

Jerzy Wydrych y Jarosław Pawelec

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SWM, MJF y KL escribieron el texto principal del manuscrito; SWM y MJF prepararon Venetin-1 para la investigación; Higos. 5, 6; SWM preparó citometría de flujo, análisis SEM, análisis TEM, análisis de microscopía de fluorescencia y análisis estadístico, preparó la Fig. 2 e información complementaria; MF creó el concepto del manuscrito, preparó análisis Cryo-SEM, Cryo-TEM, TEM y microscopía de fluorescencia y preparó las Figs. 1, 2, 4, 7, 8; ES preparó el análisis del potencial zeta y la Fig. 10 y la Tabla 2; KL preparó las figuras 5, 7; DD y AGD realizaron análisis de potencia inhibidora y prepararon la Fig. 11; JN realizó el análisis de Prometeus Panta y la Fig. 9 y la Tabla 1; JW realizó análisis microscópicos; JP realizó análisis TEM. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Kinga Lewtak o Marta J. Fiołka.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Wójcik-Mieszawska, S., Lewtak, K., Skwarek, E. et al. Autofagia de células de Candida albicans después de la acción de la nanopartícula Venetin-1 de lombriz con actividad inhibidora de proteasa. Informe científico 13, 14228 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41281-4

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Recibido: 02 de marzo de 2023

Aceptado: 24 de agosto de 2023

Publicado: 30 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41281-4

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